循環(huán)腫瘤DNA在腫瘤液體活檢中的應(yīng)用及臨床意義*

祝小薦，萬紹貴

(贛南醫(yī)學(xué)院分子病理中心，江西 贛州 341000)

癌癥是威脅人類生命健康的主要疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)2018年估計，僅2018年一年高達960萬人死于癌癥，且全世界罹患癌癥的人數(shù)還在迅速增長。最主要的原因之一是無法獲得精準的檢測和治療。準確評估腫瘤的內(nèi)在分子特點對于采取臨床有效的治療方法至關(guān)重要，分子診斷技術(shù)的進步有助于揭示腫瘤的內(nèi)在特性。

臨床上，組織活檢仍是評估大部分腫瘤特異性改變的主要手段[1]。組織活檢通常取自原發(fā)性腫瘤組織，取樣方法往往具有侵襲性，且由于腫瘤自身的異質(zhì)性，使其不能準確追蹤腫瘤的動態(tài)變化?；诮M織活檢的腫瘤評估具有很大的局限性，開發(fā)新的檢測方法是解決腫瘤危害的關(guān)鍵。臨床上，迫切需要使用非侵入性或微創(chuàng)方法，對腫瘤患者的基因組變化進行系統(tǒng)和實時監(jiān)測。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，液體活檢技術(shù)應(yīng)運而生，提供了一種非侵入性的、可重復(fù)取樣的便捷手段，應(yīng)用于腫瘤患者的輔助診斷、個體化治療、療效監(jiān)測以及跟蹤預(yù)測耐藥性突變和預(yù)后的評估等領(lǐng)域。

液體活檢，是基于血液或其他體液樣本的非侵入性技術(shù)。來自癌癥患者的體液樣本的液體活檢包含完整的循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell,CTCs)、細胞來源的囊泡 (如外泌體)以及來自腫瘤細胞的游離RNA和DNA等。這些都是評估腫瘤特異性可靠的樣本來源，且由于液體活檢的無創(chuàng)性，只要有必要，就可重復(fù)取樣，以便于實時觀察腫瘤內(nèi)部的動態(tài)變化。cfDNA起初在健康人的血液中被發(fā)現(xiàn)[2]，然而未被重視。直至1977年， Leon等[3]研究者發(fā)現(xiàn)循環(huán)血液中游離DNA (circulating cell-free DNA cfDNA)濃度在淋巴瘤和肺、卵巢、子宮、子宮頸等腫瘤患者中升高。10年后，Stroun等[4]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者較健康人血液中存在更為豐富的cfDNA。 1989年，研究者報道了在癌癥患者的cfDNA中檢測到與腫瘤基因組變化一致的片段[4],ctDNA首次進入人們的視野。ctDNA是一種存在于血液中的cfDNA,它是起始于腫瘤細胞。通常，在體內(nèi)大多數(shù)腫瘤細胞都會釋放出一些自身攜帶的DNA。普遍的說法是認為ctDNA擁有多個起源，最常見的是：(1)凋亡或壞死的腫瘤細胞，(2)活的腫瘤細胞，(3)循環(huán)的腫瘤細胞[5-7]。CTCs是從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移部位釋放進入血液的腫瘤細胞。相對于基于ctDNA的分析，CTCs捕獲的復(fù)雜性和高成本可能會限制其應(yīng)用[8-9]。同時，作為生物標記物的ctDNA檢測比CTCs檢測具有更高的敏感性[10]。而且，ctDNA的半衰期短，15分鐘到幾小時不等，在血漿中呈動態(tài)性的變化。且由于ctDNA的改變與腫瘤基因組一致，ctDNA可能是腫瘤基因組的潛在替代物，可以利用ctDNA實時監(jiān)測腫瘤基因組的變化，在腫瘤學(xué)的研究中極具潛力。

1 ctDNA檢測方法

血液作為液體活檢最主要的樣本來源。在血清中，cfDNA的含量可能是血漿中cfDNA含量的2～24倍[11-12]。但血漿的應(yīng)用性依然優(yōu)于血清，主要是血清制備過程中可能會增加野生型DNA水平，且血漿中cfDNA突變量高[13]，對腫瘤的突變分析更占優(yōu)勢。盡管cfDNA含量在癌癥患者體內(nèi)高于健康人，但是，由于肝脾腎的清除作用，cfDNA釋放到循環(huán)的含量依然很低，來源于腫瘤細胞的ctDNA比例更可能低至0.01%[14]。因此，ctDNA的標準化分析檢測對液體活檢的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，很多方法可以用于ctDNA的分析檢測。結(jié)合快速微流控分析的數(shù)字PCR顯著提高ctDNA檢測的敏感性，可以對核酸進行絕對定量[15]。在Bettegowda[10]的一項大型研究中，采用數(shù)字PCR評估ctDNA檢測腫瘤的能力，75%晚期卵巢癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等以及50%原發(fā)性腦癌、前列腺癌、腎癌可被檢出。cheng[16]也采用液滴數(shù)字PCR (ddPCR)技術(shù)檢測188例轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的基因突變。此外，結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)的BEAMing分析對ctDNA突變檢測也有較高的敏感性。Li等[17]曾利用甲基化-BEAMing準確測定樣品DNA中甲基化分子的數(shù)量。Krug等[18]研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)BEAMing分析檢測ctDNA EGFR激活的敏感性為82%，對EGFR T790M突變的敏感性為84%。此外，高通量測序(NGS)、全基因組測序(WGS) 、全外顯子組測序(WES)及ARMS等均是檢測ctDNA的可行方法。

2 ctDNA在腫瘤個性化治療上的臨床應(yīng)用

液體活檢在臨床上的應(yīng)用是多方面的，ctDNA作為一種可以提供腫瘤關(guān)鍵信息，廣泛適用于癌癥的潛在生物標志物也備受期待(圖1)。

圖1 ctDNA的潛在應(yīng)用

2.1評估腫瘤疾病負擔Bettegowda評估了大量的癌癥類型發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腦外實體瘤中均可檢測到ctDNA(82%)。同時，患者體內(nèi)ctDNA濃度與腫瘤的類型、分期及進展有關(guān)。他們的研究發(fā)現(xiàn)局限性癌癥患者血漿ctDNA濃度低于轉(zhuǎn)移性癌癥患者，晚期癌癥患者或轉(zhuǎn)移患者血液循環(huán)中，突變DNA片段濃度相對較高[10]。此外，早有研究者發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中ctDNA濃度高于大多數(shù)常用生物標志物[19]，而晚期乳腺癌患者與ctDNA濃度也存在類似的聯(lián)系[20]。腦脊液中ctDNA深度測序也被證明是可以檢測腦干腫瘤特異性改變的可靠技術(shù)[21]。Spina等[22]回顧分析了349例CHL癌癥患者血液和組織樣本，表示ctDNA確實可以提供腫瘤組織內(nèi)包括cHL分期及預(yù)后在內(nèi)的關(guān)鍵信息。在結(jié)腸癌或胰腺癌中無法治愈的階段， ctDNA也被發(fā)現(xiàn)可能反映晚期癌癥的疾病負擔。腫瘤的疾病負擔是指腫瘤帶來的人類各方面的損失，這不止是身體上的，還包括精神以及經(jīng)濟方面的損失等。通常早期患者的ctDNA水平較低，ctDNA大多數(shù)在患者疾病中晚期階段被發(fā)現(xiàn), ctDNA在早期腫瘤患者的豐度是大約10倍低于進展期的患者，還需要進一步改進技術(shù)，以達到可接受的早期癌癥檢測靈敏度。ctDNA的豐度確實與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，這種聯(lián)系很可能是正相關(guān)的，提示其可作為腫瘤疾病負擔的替代標志物。

在不同癌癥類型和分期中，ctDNA檢測出的片段大小也不同。早在20多年前，人們就發(fā)現(xiàn)健康人平均血漿DNA長度超過癌癥患者[23]。不久前，Mouliere等[24]對來自18種不同癌癥類型的患者的344份血漿樣本和來自健康對照組的65份血漿樣本中生成的cfDNA片段特征分析發(fā)現(xiàn)，健康個體血漿和晚期膠質(zhì)瘤、腎癌、胰腺癌、膀胱癌患者血漿cfDNA片段長度明顯長于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、膽管癌等晚期癌癥。他們發(fā)現(xiàn)對cfDNA片段大小分析和特定片段大小的選擇性測序可促進ctDNA檢測。Florent等[25]也發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的ctDNA根據(jù)ctDNA片段的大小呈現(xiàn)出特定的量譜。不難發(fā)現(xiàn)， ctDNA的總長度始終小于正常無細胞DNA的片段長度。Underhill等[26]的研究也為這結(jié)果提供了令人信服的證據(jù)。因此，來自各種實體腫瘤的cfDNA和ctDNA在片段長度上的這種細微但明顯的差異為ctDNA在實體腫瘤檢測和診斷中的臨床應(yīng)用提供了潛在的標志物，且在監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，評估腫瘤對治療的反應(yīng)上也有一定的價值。

2.2監(jiān)測治療反應(yīng)診斷出癌癥后，制定合適的治療管理方案是最重要的一環(huán)。腫瘤個性化治療的一個重點，在于干預(yù)特定突變驅(qū)動信號。由ctDNA定義的大多數(shù)常見突變已經(jīng)被用于監(jiān)測癌癥患者的治療，包括肺癌EGFR基因突變、結(jié)直腸癌KRAS基因突變、乳腺癌TP53、PIK3CA基因突變、前列腺癌AR基因突變等。例如，Murtaza[27]和他的同伴為探索治療后轉(zhuǎn)移性癌癥的基因組進化，對大量來自血漿樣本中的癌癥外顯子組測序，包括紫杉醇治療后PIK3CA的激活突變;順鉑治療后RB1的截斷突變;用他莫昔芬和曲妥珠單抗治療后MED1發(fā)生截斷突變，吉非替尼治療后表皮生長因子受體EGFR T790M突變，這些突變表達增加可以解釋治療后出現(xiàn)的耐藥性。ctDNA KRAS分析也被證明可以用于監(jiān)測胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者的治療反應(yīng)，且發(fā)現(xiàn)其至少與常用的生物標志物CA199作用相當，甚至隨著時間推移，比CA199的動態(tài)變化更能預(yù)測患者生存和預(yù)后[28]。研究員們還試圖通過ctDNA尋找可靶向治療的突變，在Spina等[22]的研究中，通過收集了經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(CHL)患者化療或免疫治療后以及治療后復(fù)發(fā)的縱向標本，來評估治療帶來的腫瘤基因上的改變。另一項研究里，Taus等[29]對33例肺腺癌患者的221份血漿標本進行了分析，在83%的患者和100%的胸外轉(zhuǎn)移患者血漿中檢測到EGFR突變。他們分析發(fā)現(xiàn)EGFR突變負荷的動態(tài)變化可以預(yù)測患者治療反應(yīng)和疾病進展，而且這種預(yù)測發(fā)生在放射學(xué)評估之前。一些ctDNA標記甚至可以指導(dǎo)腫瘤的治療，血漿中發(fā)現(xiàn)EGFR致敏突變的非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌患者可以用厄洛替尼治療[30]，血漿T790M陽性的患者可使用奧西莫替尼治療[31]，野生型KRAS原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤患者可接受EGFR治療[32]， ctDNA中BRCA2突變的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者被證實對順鉑化療更為敏感[16]。Wolff等[33]證明以血液為基礎(chǔ)的RAS突變試驗，可以替代組織RAS檢測，確定轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(mCRC)患者是否適合抗EGFR治療。一項Ⅲ期臨床試驗也證實，口服表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱可延長晚期胰腺癌患者無進展生存期[34]。Zou[35]也強調(diào)了連續(xù)ctDNA監(jiān)測在接受靶向治療和免疫治療的NSCLC患者中的潛在臨床應(yīng)用價值。綜上可見，ctDNA檢測可提醒耐藥性突變的出現(xiàn)，并提示治療中腫瘤狀態(tài)的改變，有利于監(jiān)測腫瘤演變以及預(yù)測耐藥性，為腫瘤患者的精準治療提供依據(jù)。

2.3預(yù)后的評估近年來，由于很難獲得足夠數(shù)量和質(zhì)量的腫瘤組織，且重復(fù)活檢受到各種條件的限制，給腫瘤治療的預(yù)后研究帶來了困難?；赾tDNA的液體活檢有助于克服這個困難。在一項前瞻性研究中[36]，ctDNA的存在與晚期胰腺癌較差的總生存率以及手術(shù)后較短的無病生存期相關(guān)，ctDNA被證明是晚期胰腺腺癌的獨立預(yù)后標志物。同樣，Spina和他的同伴們[22]也發(fā)現(xiàn)在ABVD方案(阿霉素、博萊霉素、長春花堿和達卡巴嗪)治療2個療程后，完全緩解或治愈的CHL患者比復(fù)發(fā)患者ctDNA濃度下降更大。不久前， Turner等[37]觀察到早期乳腺癌治療后檢測到ctDNA與其復(fù)發(fā)的高風(fēng)險相關(guān)，且其對所有腫瘤亞型均有預(yù)測作用。Coombes等[38]也得到了相似的結(jié)果。相關(guān)的研究也展示了ctDNA在結(jié)直腸癌[39]及黑色素瘤[40]等治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測作用。當然，由于研究樣本量小，ctDNA的檢測是否對全部癌癥都有預(yù)后價值還需進一步研究。由于ctDNA的半衰期短，可以動態(tài)的監(jiān)測腫瘤基因組的變化，實時提供分子異常信息?；赾tDNA可發(fā)現(xiàn)影響預(yù)后的突變，這在很多研究中有所體現(xiàn)。例如Provencio等[41]研究表明EGFR T790M突變等位基因頻率與NSCLC患者死亡和疾病進展的風(fēng)險顯著正相關(guān)。Zhang等[42]也認為，在隨訪過程中密切監(jiān)測EGFR突變，可以預(yù)測接受酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向治療的NSCLC患者的預(yù)后。Yam等[43]研究也得到相似的結(jié)果。ctDNA中的BRCA逆轉(zhuǎn)突變更是能預(yù)測高級別卵巢癌對PARP抑制劑的原發(fā)性和獲得性耐藥[44]。此外，胰腺癌的KRAS突變[16]，非小細胞肺癌的EGFR突變[45]，乳腺癌的HER2[46]等都與不良預(yù)后有關(guān)。研究證明，ctDNA的功用不止如此，其在預(yù)測腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移上也有足夠的潛力，Sausen[47]也通過ctDNA分析比放射成像早6個月發(fā)現(xiàn)9例手術(shù)后胰腺癌患者的復(fù)發(fā)。甚至，在1例同時患乳癌與直腸癌的中年女性在接受手術(shù)治療2年后，ctDNA圖譜提示與直腸癌樣本相同的多種體細胞突變，由此證實了直腸癌復(fù)發(fā)[48]。Maron等[49]還探索ctDNA基因組改變的分布在進展期胃食管腺癌的預(yù)后影響。ctDNA分析可用于評估特定基因、ctDNA負擔以及腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性，有望成為預(yù)后和預(yù)測的生物標志物，值得進一步研究。

2.4其他某些特定性突變可提示腫瘤的特殊類型，例如，BRAF癌基因的點突變主要見于甲狀腺乳頭狀癌[50]。p53突變也發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、肝癌、腦癌、內(nèi)皮網(wǎng)癌和造血癌等不同類型的癌癥中常見，且p53的突變譜各不相同[51]。對ctDNA中這些突變的分析可以為這些不同腫瘤的病因和個性化治療靶點提供線索。也有研究探索ctDNA在癌癥患者的早期檢測上的意義，確實，ctDNA檢測有助于對胰腺癌[52]、乳腺癌[37]及非小細胞肺癌[53]等腫瘤的早期診斷，且有可能實現(xiàn)早期預(yù)測腫瘤的進化和轉(zhuǎn)移[54-56]?？上У氖窃缙诩膊≈衏tDNA濃度極低，且循環(huán)突變片段起源組織的這種不確定性也為基于ctDNA進行的腫瘤早期檢測增加了困難和挑戰(zhàn)[57]。

3 困難與挑戰(zhàn)

ctDNA作為有意義的生物學(xué)標志物，在腫瘤精準醫(yī)學(xué)和個性化治療上展示了巨大的潛力。ctDNA檢測為癌癥診斷、監(jiān)測、預(yù)后判斷和治療提供了一種無侵入性、簡便易行的方法。更甚之，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，ctDNA檢測可以提供更為完整的生物學(xué)信息[58]。然而，ctDNA的臨床使用上仍然存在困難。如ctDNA的高碎片化和循環(huán)中的低濃度，對其定量及檢測是一種挑戰(zhàn)。其次，方法的標準化、敏感性、與腫瘤組織的一致性、調(diào)控問題等需要考慮。同時，不同人的 ctDNA 水平有所差異。對此，需要對可靠的、標準化的ctDNA檢測方法達成一致。 第三，cfDNA也被發(fā)現(xiàn)在生理和非癌變病理條件下濃度增加，而且，有研究表明，即使是那些從未患過癌癥的人，癌癥相關(guān)的突變也會隨著年齡的增長而發(fā)生[59]。這對通過ctDNA圖譜檢測突變和疾病的預(yù)判增加了難度。最后，ctDNA檢測的成本效益也值得重視，盡管不少公司和實驗室在開發(fā)這類測試方面非常積極，但其高成本還是限制其臨床應(yīng)用。總之，盡管ctDNA液體活檢具有高靈敏和微/無創(chuàng)性等優(yōu)點，這一領(lǐng)域的發(fā)展在癌癥的精準治療中具有廣闊的前景，但其完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測方法還有很長的一段路要走，其廣泛應(yīng)用在臨床前還需進一步探索。