循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展及其臨床應(yīng)用*

古肖湘，吳雄健，祝小薦， 萬紹貴

(贛南醫(yī)學(xué)院 1.第一臨床醫(yī)學(xué)院；2.第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科；3.分子病理中心，江西 贛州 341000)

癌癥是嚴(yán)重危害人類健康的最惡性疾病之一，且全球癌癥發(fā)病率和死亡率正在迅速上升[1]。復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者預(yù)后不良和死亡的主要原因[2]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)的存在被認(rèn)為與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移相關(guān)。CTCs從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤脫落，通過血液循環(huán)進(jìn)行遷移，在遷移過程中大多數(shù)CTCs經(jīng)過失巢凋亡或受到血流剪切應(yīng)力機(jī)械損傷以及機(jī)體免疫細(xì)胞消除作用，最終僅有<0.01%具有高轉(zhuǎn)移潛能的CTCs可以存活，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在遠(yuǎn)處器官中形成新腫瘤[3]。由于CTCs源自原發(fā)或轉(zhuǎn)移瘤灶，攜帶腫瘤和轉(zhuǎn)移組織的遺傳和表型的生物學(xué)信息，可以增加對(duì)腫瘤和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散過程的了解，并且可以對(duì)疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。傳統(tǒng)的活組織檢查受到采樣偏倚及可采樣組織區(qū)域的限制，且通常侵入性較大[4]。通過常規(guī)抽血獲得的CTCs的檢測(cè)，即液體活檢，與傳統(tǒng)的組織活檢“金標(biāo)準(zhǔn)”相比，是一種創(chuàng)新且明顯侵入性更小的技術(shù)，且?guī)缀蹩梢灾貜?fù)取樣，因而更安全和時(shí)效性更高，已受到研究人員們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注。CTCs在早期診斷、評(píng)估療效和判斷預(yù)后等方面扮演重要角色，為腫瘤的診斷和治療開創(chuàng)了新的視野。因此,捕獲血液中的CTCs進(jìn)行檢測(cè)和分析具有十分重要的臨床意義，本文就CTCs的檢測(cè)技術(shù)和相關(guān)臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 CTCs檢測(cè)技術(shù)

CTCs在血流中含量極低，每毫升人外周血中的CTCs 不到 1 個(gè)(白細(xì)胞數(shù)量5×106～10×106/mL，紅細(xì)胞數(shù)量5×109～9×109/mL)[5]，使得CTCs難以捕獲和研究。目前CTCs的檢測(cè)技術(shù)一般分為兩大環(huán)節(jié)，即分離富集和識(shí)別鑒定。

1.1 CTCs的分離富集技術(shù)

1.1.1物理分離富集方法物理方法，是基于CTCs與血細(xì)胞在大小、密度、可變形性、電性質(zhì)的方面的差異所采用的分離富集方法，此方法不依賴于EpCAM或其他細(xì)胞表面上的特異性抗原的表達(dá)。

ISET系統(tǒng)[6]屬于徑跡蝕刻聚碳酸酯過濾器，使用原理是利用CTCs 尺寸一般比外周血細(xì)胞更大的特點(diǎn)，將血樣通過8 μm直徑孔徑的聚碳酸酯Track-Etch型膜過濾，把血細(xì)胞濾過，從而將 CTCs富集。此類過濾器是通過徑跡蝕刻聚碳酸酯制備而成，其孔隙大小不一、密度較小，且常導(dǎo)致兩個(gè)孔以上的多孔隙融合，捕獲CTCs的效率較低，為50%～60%[5]。為了提高CTCs的捕獲效率，zheng等[7]設(shè)計(jì)了通過光刻法制作了一種孔徑為10 μm，且孔徑大小、形狀和密度相同的聚對(duì)二甲苯層的孔形過濾器，CTCs的捕獲效率提高為90%。Harouaka, R.A等[8]設(shè)計(jì)了柔性微彈簧陣列FMSA裝置，里面包含有壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)，可減少CTCs在富集過程中的機(jī)械應(yīng)力損傷，且樣品無需進(jìn)行預(yù)處理，可直接從全血中富集CTCs，捕獲在過濾器上的CTCs仍保持其活力，并且還對(duì)捕獲的CTCs進(jìn)行對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記波形蛋白測(cè)試，約86%是陽性的，其可以提供診斷和預(yù)后的信息。ANGLE開發(fā)一種稱為Parsortix的一次性微流體盒，該裝置是基于細(xì)胞大小和可變形性的差異來富集細(xì)胞，其內(nèi)置有單向的階梯式分離結(jié)構(gòu)，可提供10 μm到4.5 μm范圍的不同尺寸的臨界間隙，樣品通過階梯結(jié)構(gòu)并穿過臨界間隙，在合適的“臨界間隙”根據(jù)其不易變形的性質(zhì)和大小捕獲CTCs[9]。Seal注意到紅細(xì)胞的相對(duì)密度為1.092，白細(xì)胞的相對(duì)密度為1.065，腫瘤細(xì)胞的相對(duì)密度為1.056[10]。利用此特性，OncoQuick系統(tǒng)通過使用密度梯度離心和過濾結(jié)合在一起的方法，其在分離介質(zhì)上方的系統(tǒng)中安置多孔屏障，并允許紅細(xì)胞和白細(xì)胞通過濾除，而CTCs留存于介質(zhì)層中。使用OncoQuick系統(tǒng)時(shí)可使單核細(xì)胞的數(shù)量降低，從而為樣品處理和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)簡(jiǎn)化了工作流程[11]。CTCs和正常健康血細(xì)胞在電場(chǎng)中可以產(chǎn)生不同大小和方向的偶極矩，兩者之間受到不同的電動(dòng)力產(chǎn)生不同的運(yùn)動(dòng)軌跡。ApoStreamTM通過利用這點(diǎn)差異，在微流體流動(dòng)室中使用介電電泳技術(shù)來捕獲CTCs[12]?；谖锢淼募夹g(shù)有可以快速簡(jiǎn)單地生成無標(biāo)記，未修飾和可存活的細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，其捕獲效率高和富集效果好，但缺點(diǎn)是有些較小的CTCs可能與白細(xì)胞尺寸上存在大小相同，導(dǎo)致可能未能富集樣品中較小的CTCs[13]。

1.1.2免疫分離富集方法免疫分離富集方法是通過特異性抗體靶向表面抗原來將CTCs與其他血細(xì)胞分離。但由于CTCs表面抗原具有高度異質(zhì)性，目前尚未鑒定出通用的CTCs特異性腫瘤標(biāo)記物[14]。免疫分離富集方法分為陽性富集和陰性富集。陽性富集方法是通過腫瘤特異性抗體靶向腫瘤細(xì)胞的特異性抗原，如上皮表面腫瘤標(biāo)記物(EpCAM)抗體。陰性富集是通過靶向白細(xì)胞表面抗原標(biāo)志物，如CD45，從而去除白細(xì)胞后捕獲CTCs[15]。免疫分離富集方法有免疫磁珠法、微流體芯片免疫捕獲法、微流體芯片+納米材料法。

CellSearch系統(tǒng)是基于免疫磁珠法陽性富集法的代表，也是目前為止的唯一獲得食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市的具有預(yù)后價(jià)值的CTCs檢測(cè)技術(shù)[13]。CellSearch使用原理是由包覆上皮細(xì)胞特異性EpCAM抗體的免疫磁珠捕獲表達(dá)EpCAM細(xì)胞，然后用細(xì)胞角蛋白8、18、19和CD45熒光抗體以及核染料4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光標(biāo)記細(xì)胞對(duì)CTCs進(jìn)行篩選分離，捕獲的樣品在四色半自動(dòng)熒光顯微鏡CellSpotterAnalyzer上進(jìn)行分析[16]。然而有研究表明在侵襲性腫瘤中通常會(huì)出現(xiàn)上皮向間充質(zhì)過渡(EMT)過程，導(dǎo)致上皮標(biāo)記物的下調(diào)[17]。因此，對(duì)上皮細(xì)胞的陽性富集可能會(huì)漏檢轉(zhuǎn)移疾病方面中最重要的CTCs，且與設(shè)備表面結(jié)合的CTCs難以釋放。為解決該情況，研究人員設(shè)計(jì)了MagSweeper系統(tǒng)，該裝置使用覆蓋有可移除的超薄(25 μm)非粘附塑料套管的圓底釹磁棒捕獲用磁性顆粒預(yù)標(biāo)記的稀釋血液樣品中的CTCs，可允許多次捕獲和釋放循環(huán)，實(shí)現(xiàn)高純度分離和高捕獲效率[18]。此外基于免疫磁性陽性富集策略技術(shù)的還有MACS系統(tǒng)[19]、Strep-tag?系統(tǒng)[20]。Cyttel系統(tǒng)是免疫磁性陰性富集的代表，利用CD45免疫磁珠偶聯(lián)血液樣品中的白細(xì)胞，然后通過磁場(chǎng)對(duì)其去除從而間接富集CTCs[21]。

基于免疫磁珠系統(tǒng)通常步驟較多(如離心、洗滌和孵育)，導(dǎo)致大部分CTCs的損失和/或破壞，且只能分離固定的，無活力的細(xì)胞。CTC芯片是第一個(gè)能夠成功處理全血捕獲CTCs的微流體裝置(CTC-Chip)，CTC芯片的獨(dú)特之處在于可以從全血中分離活的CTCs，且無需預(yù)稀釋、預(yù)標(biāo)記、預(yù)固定或其他樣品處理步驟。CTC芯片由78 000個(gè)一系列微柱(帶有抗EpCAM抗體)陣列組成，當(dāng)血樣流經(jīng)微柱時(shí)，抗EpCAM與血液中CTCs結(jié)合從而捕獲CTCs。通過優(yōu)化微柱幾何排列和液體流速及剪切力，細(xì)胞與微柱的相互作用增強(qiáng)，提高細(xì)胞捕獲效率[22]。在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌和胰腺癌等轉(zhuǎn)移性癌癥患者外周血使用CTC-Chip裝置CTCs捕獲的純度可以達(dá)到50%[13]。雖然CTC-Chip提高了CTCs的捕獲效率，但CTC-Chip受控于層流，使CTCs與微柱表面的相互作用受到限制，且由于復(fù)雜的微柱幾何結(jié)構(gòu)的構(gòu)造，使得難以進(jìn)行擴(kuò)大制造和臨床的大規(guī)模應(yīng)用。Stott, S.L等[23]研發(fā)了“第二代”免微流體芯片,一種高通量微渦旋混合裝置(HB-Chip)，具有適合大規(guī)模生產(chǎn)的簡(jiǎn)單幾何設(shè)計(jì)，該裝置透明壁(涂覆抗EpCAM的抗體)內(nèi)使用人字形的微通道來產(chǎn)生微渦流，增強(qiáng)CTCs與抗體包被的芯片表面之間的相互作用，提高了CTCs捕獲產(chǎn)量和純度。

納米結(jié)構(gòu)可以增加癌細(xì)胞粘附和結(jié)合的表面積，又有利于增加癌細(xì)胞和抗體的接觸量[13]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)涂覆有細(xì)胞捕獲劑(如抗EpCAM)的納米結(jié)構(gòu)基底結(jié)合微流體技術(shù)可以提高CTCs捕獲效率[24]。人字形芯片(NP-HB CTC-Chip)是在HB CTC-Chip表面上組裝有硫醇修飾的金納米粒子(AuNPs)進(jìn)行硫醇化配體交換反應(yīng)從而釋放捕獲的癌細(xì)胞，用于隨后的CTCs分子分析。與HB CTC-Chip相比，NP-HB CTC-Chip的捕獲效率更高(82% VS 99%)[25]。

1.2 CTCs的鑒定技術(shù)CTCs的鑒定通常用免疫細(xì)胞化學(xué)法(immunocytochemistry，ICC)、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)等技術(shù)。其中ICC是通過顯色劑標(biāo)志過的特異性抗體結(jié)合腫瘤細(xì)胞表面的特異性抗原的抗原抗體反應(yīng)對(duì)CTCs進(jìn)行識(shí)別分析和計(jì)數(shù)，將EpCAM(+) CK(+) CD45(-) DAPI(+) 的細(xì)胞作為CTCs的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)。該方法簡(jiǎn)單且效率高，但由于CTCs 表面標(biāo)志物表達(dá)存在差異，致使其敏感性降低。RT-PCR是利用CTCs表達(dá)特異性的mRNA，而正常血細(xì)胞不表達(dá)的特點(diǎn)來鑒定 CTCs，敏感性較高，但假陽性也較高，且因檢測(cè)需破壞細(xì)胞而無法觀察細(xì)胞形態(tài)。FCM是借助單克隆抗體和熒光染料結(jié)合CTCs進(jìn)行染色， 然后對(duì)染色的CTCs進(jìn)行定量分析的技術(shù)。FISH利用熒光素標(biāo)記了的核酸探針對(duì)CTCs進(jìn)行鑒定，具有更高敏感度和特異性，但由于基因的表達(dá)存在異質(zhì)性，探針不能針對(duì)所有的靶細(xì)胞。

2 CTCs的臨床應(yīng)用

CTCs檢測(cè)作為簡(jiǎn)單的、快速的、方便的和微創(chuàng)的診斷方法，可以幫助評(píng)估腫瘤患者病情和判斷預(yù)后，以及評(píng)估治療效果，在早期和轉(zhuǎn)移性癌癥中具有重要意義(表1)。

表1 CTCs的臨床應(yīng)用總結(jié)

2.1在乳腺癌中的應(yīng)用在非轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中大約10%～30%可以檢測(cè)到CTCs[26]。CTCs陽性與乳腺癌患者年齡、瘤體大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織病理學(xué)類型及激素受體無關(guān)，與脈管侵犯有關(guān)。CTCs代表乳腺癌轉(zhuǎn)移能力，且能成為乳腺癌的預(yù)后因子[27]。Cristofanilli M等[28]對(duì)18個(gè)隊(duì)列的2 436例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總分析發(fā)現(xiàn)，CTCs 的數(shù)目≤5個(gè)CTCs/7.5 mL的患者比CTCs的數(shù)目≥5 個(gè)CTCs/7.5 mL的患者的無進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS) 和總生存期(overall survival，OS)明顯延長。Ma S等[29]對(duì)187例乳腺癌患者(BC)進(jìn)行5-氟尿嘧啶/表柔比星/環(huán)磷酰胺(FEC)治療以及3年的隨訪研究中發(fā)現(xiàn)，接受3個(gè)周期的治療后，65.8%的BC患者實(shí)現(xiàn)了完全反應(yīng)(CR)+部分反應(yīng)(PR)，化療后CTCs計(jì)數(shù)下降(P<0.05)，證明了CTCs計(jì)數(shù)可作為BC患者化療的短期和長期療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

2.2在結(jié)直腸癌中的應(yīng)用Wensy等[30]在620例結(jié)直腸癌(CRC)篩查的前瞻性臨床研究中發(fā)現(xiàn)，CTCs檢出癌前病變的敏感性為 76.6%，CRC檢出的敏感性為 86.9%，癌前病變和CRC檢出的準(zhǔn)確率高達(dá)88.0%。表明CTCs檢測(cè)有助于CRC的早期篩查。在一項(xiàng)對(duì)121例晚期CRC患者的回顧性研究中表明，CTCs的陽性率與浸潤深度、淋巴結(jié)浸潤、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、血清CEA水平有關(guān)，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤脫分化無關(guān)，并證實(shí)CTCs可以作為晚期CRC患者接受化療時(shí)PFS和OS的獨(dú)立預(yù)后因素[31]。Sun JJ等[32]選取98例晚期結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者進(jìn)行高溫灌注化療，在接受2個(gè)療程后，患者的間接抗腫瘤作用的免疫功能改善，CTCs陽性率顯著降低，且存活時(shí)間延長，證明治療有效，CTCs可以作為評(píng)估治療的指標(biāo)。

2.3在肺癌中的應(yīng)用CTCs和血清腫瘤標(biāo)志物的組合有助于提高肺癌的診斷率。在Li Y等[33]的研究中，發(fā)現(xiàn)CTCs和腫瘤標(biāo)志物組合(CEA、CA125、CYFRA 21-1和SCC)肺癌診斷的敏感性分別為68.29%和63.41%。 然而，所有這些肺癌診斷標(biāo)志物的組合敏感性高達(dá)82.93%，對(duì)癌癥早期(Ⅰ和Ⅱ)診斷的敏感性為78.69%。使用CTCs、CYFRA 21-1和SCC的組合對(duì)鱗狀細(xì)胞癌的陽性診斷率為97.14%。Tong B等[34]對(duì)43例非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的前瞻性研究中發(fā)現(xiàn)，共有78.69%的患者CTCs陽性(每3.2 mL血液≥2個(gè)CTCs)，<3.2個(gè)CTCs/3.2 mL的患者的PFS和OS比≥8個(gè)CTCs/3.2 mL患者的PFS和OS較長，CTCs計(jì)數(shù)是PFS和OS的強(qiáng)預(yù)測(cè)因子。Messaritakis I等[35]研究發(fā)現(xiàn)帕唑帕尼對(duì)復(fù)發(fā)性小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者不同亞群的CTCs有明顯影響。帕唑帕尼治療顯著降低了CTCs數(shù)量，高數(shù)量的CTCs與PFS和OS的減少相關(guān)，在治療過程中VEGFR2+CTCs的檢測(cè)可能與對(duì)帕唑帕尼的耐藥性相關(guān)。

2.4在前列腺癌中的應(yīng)用在前列腺癌中(Prostate cancer，PC)，由于目前的CTCs檢測(cè)方法還不夠靈敏，還不能用于PC的早期檢測(cè)[36]。相對(duì)于被廣泛用于PC的檢測(cè)和復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)生物標(biāo)志物PSA，CTCs計(jì)數(shù)的減少不依賴于雄激素調(diào)節(jié)，因此反應(yīng)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和疾病負(fù)擔(dān)的減少。Resel FL等[37]對(duì)30例轉(zhuǎn)移性激素敏感性前列腺癌的前瞻性的研究中發(fā)現(xiàn)CTCs水平與前列腺特異性抗原和T、N和M分期存在正相關(guān)。每7.5 mL≥4個(gè)CTCs的患者的OS和PFS中位數(shù)顯著縮短，每7.5 mL≥4個(gè)CTCs是PFS獨(dú)立的預(yù)后因素。在去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)的COU-AA-301(化療后阿比特龍治療)和IMMC-38(一線化療)的兩項(xiàng)前瞻性試驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，與每7.5 mL≥5個(gè)CTCs細(xì)胞的患者相比，每7.5 mL<5個(gè)CTCs細(xì)胞的患者存活率較高，且證實(shí)了阿比特龍為CTCs≥5個(gè)CTCs/7.5 mL的患者提供了顯著的生存獲益。每7.5 mL≥5個(gè)CTCs的CRPC患者治療后CTCs下降30%與總生存率獨(dú)立相關(guān)[38]。在一項(xiàng)多中心、前瞻性的研究中表明CTCs衍生的AR-V7陽性的高風(fēng)險(xiǎn)轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌(mCRPC)的男性，幾乎沒有阿比特龍或恩雜魯胺治療后的臨床獲益證據(jù)，PSA下降的概率非常低，OS和PFS也較短，因此認(rèn)為AR-V7可以作為用阿比特龍或恩雜魯胺治療的mCRPC患者的臨床結(jié)果的預(yù)后生物標(biāo)志物[39]。

2.5在其他腫瘤中的應(yīng)用CTCs也被發(fā)現(xiàn)存在其他腫瘤中，如胰腺癌[40]、肝細(xì)胞癌[41]、鼻咽癌[42]等。在Okubo K等[40]的研究中發(fā)現(xiàn)CTCs陽性的胰腺癌患者總生存率明顯低于CTCs陰性的胰腺癌患者。CTCs計(jì)數(shù)可作為預(yù)測(cè)晚期胰腺癌患者的化療預(yù)后和治療反應(yīng)的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。CTCs在90.18%的肝細(xì)胞癌患者和超過50%的早期肝細(xì)胞癌患者中可以檢測(cè)到，且術(shù)后監(jiān)測(cè)CTCs水平還可預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)[41]。最近研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者中CTCs的檢出率為92.0%，且CTCs數(shù)量與鼻咽癌患者血漿EBV DNA水平呈正相關(guān)，CTCs可作為鼻咽癌患者治療、診斷和隨訪的生物標(biāo)志物[42]。

3 結(jié)語和未來方向

CTCs攜帶了腫瘤組織的遺傳和生物學(xué)信息，可以為腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展，以及化療敏感性和耐藥性提供新的視角和維度。CTCs檢測(cè)的未來方向是下游分析，CTCs的基因組譜分析可能對(duì)癌癥的診斷和治療更有幫助。CTCs計(jì)數(shù)結(jié)合分子譜分析，可以檢測(cè)CTCs亞群、癌癥亞型和導(dǎo)致癌癥發(fā)生發(fā)展和耐藥性的基因突變[13]。使用精確和高通量的下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)，可以對(duì)單個(gè)CTCs進(jìn)行基因分型[43]，用于腫瘤的突變分析。下游分子分析要求更可靠的分離和富集技術(shù)，從而捕獲高純度和可行的CTCs用于下游分析[44]。但是，目前為止，由于CTCs異質(zhì)性的存在，CTCs檢測(cè)方法尚有許多不足，基于免疫親和性的CTCs分離方法，由于CTCs在血液中經(jīng)歷上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，其抗原性丟失,從而可能導(dǎo)致假陰性的結(jié)果[14]，且CTCs結(jié)合至裝置表面增加了CTCs無損釋放的難度?；谏镂锢碓淼腃TCs分離技術(shù)，因CTCs與白細(xì)胞等血細(xì)胞的生物物理特性存在一定交叉，導(dǎo)致獲得的CTCs純度不高。因此迫切需要開發(fā)一種更靈敏、更具特色、更簡(jiǎn)便高效的檢測(cè)系統(tǒng)。CTCs檢測(cè)的臨床實(shí)用性需要進(jìn)行進(jìn)一步的大規(guī)模的研究進(jìn)行驗(yàn)證，但其多功能性和優(yōu)勢(shì)為癌癥的診斷和預(yù)后提供了新的工具，相信在未來幾年循環(huán)腫瘤細(xì)胞將大大促進(jìn)精準(zhǔn)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。