夜來(lái)香根莖多糖超聲提取工藝*

張賽男，王妙飛，曾 靖，肖 海，張道英，丁期有

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

夜來(lái)香(Cestrum noctrnum，Linn)，又名夜香樹(shù)、夜香花、夜丁香、洋素馨，為茄科夜香樹(shù)屬植物，原產(chǎn)于南美洲[1-2]，現(xiàn)在我國(guó)主要分布在南方的廣東、廣西、福建等地，每年開(kāi)花約6次。夜來(lái)香始記載于《中國(guó)高端植物圖鑒》[3]，性溫味辛，入胃經(jīng)，有行氣止痛鎮(zhèn)定[4],鎮(zhèn)靜催眠[5]的功效，用于治療胃脘痛。夜來(lái)香在民間栽培主要用于觀賞、驅(qū)蚊和藥用[6-7]。其夜間盛開(kāi)花朵氣味芬芳濃郁，常用來(lái)調(diào)配制成香精；它所含的揮發(fā)油成分有驅(qū)蚊的作用[8]，所以又經(jīng)常被制成驅(qū)蚊液等。夜來(lái)香的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、皂苷類、黃酮類、多糖及酚類化合物等。

1 材料、儀器與試劑

1.1植物材料從江西省采集得到夜來(lái)香藥材。經(jīng)過(guò)贛南醫(yī)學(xué)院程齊來(lái)教授的鑒定，是茄科夜香樹(shù)屬植物夜來(lái)香(Cestrum noctrnum，Linn)的根莖。取夜來(lái)香根莖烘干粉碎過(guò)篩后備用。

1.2試劑與儀器D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司；苯酚、95%乙醇，均為分析純，購(gòu)于福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司；濃硫酸，分析純，購(gòu)于西隴科學(xué)有限公司。

FWB5中草藥粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；BSA224S分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；KQ-500DB數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101-2-S-Ⅱ電熱恒溫古風(fēng)干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠； UV6100PCS紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；Exceed-Ad-16艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)，成都艾柯水處理設(shè)備有限公司；TDZ4-WS低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1多糖的含量測(cè)定

2.1.1對(duì)照品溶液的制備萬(wàn)分之一分析天平取10.00 mg D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，倒入100 mL容量瓶，倒超純水至100 mL止，溶解均勻。制得濃度100 μg·mL-1的葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備稱取0.50 g夜來(lái)香根莖粉末，以1∶40 g·mL-1的物料與液體的比例加入超純水。30 ℃，超聲(500 W，40 kHz)30 min，用超純水進(jìn)一步補(bǔ)充失重重量，濾過(guò)，向?yàn)V液中倒無(wú)水乙醇至乙醇濃度為80%，用于醇沉淀。在醇沉24 h后，濾過(guò)晾干，所得殘余物就是粗多糖。另拿10 mL容量瓶用超純水溶解粗多糖到其中并倒?jié)M10 mL止。取離心試管移入5.0 mL粗多糖溶液。以3 000 r 旋轉(zhuǎn)離心操作10 min，過(guò)濾，并繼續(xù)濾液作為測(cè)試溶液。

2.2夜來(lái)香根莖多糖含量測(cè)定方法的建立

2.2.1溶液的顯色準(zhǔn)確吸取1.0 mL供試品溶液于10 mL容量瓶中。用超純水添加到2 mL，移入5%苯酚溶液1 mL，最后加濃硫酸定容到10 mL。顯色完成。

2.2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的確定取對(duì)照品溶液和供試品溶液各1.0 mL，按照顯色方法進(jìn)行顯色，顯色后掃描波長(zhǎng)，葡萄糖對(duì)照品溶液和夜來(lái)香根莖供試品溶液在490 nm處均有最大吸收波長(zhǎng)，所以選擇 490 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，顯色后用UV分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，其中，使用0.0 mL對(duì)照品作為對(duì)照，葡萄糖吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：A=0.076 4C-0.009，R2=0.999 6，樣品濃度在2.02～12.12 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。以葡萄糖對(duì)照品吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.4夜來(lái)香根莖多糖得率的計(jì)算取夜來(lái)香根莖供試品溶液1.0 mL，按照顯色方法進(jìn)行顯色后測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖的得率。多糖得率(%)=夜來(lái)香根莖中多糖質(zhì)量/夜來(lái)香根莖質(zhì)量×100%。

2.3單因素實(shí)驗(yàn)在其他條件均不變的條件下，研究提取溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃)、提取時(shí)間(15 min、25 min、35 min、45 min、55 min)和料液比(1∶20 g·mL-1、1∶30 g·mL-1、1∶40 g·mL-1、1∶50 g·mL-1、1∶60 g·mL-1)對(duì)夜來(lái)香根莖多糖提取的影響。

以超純水為提取溶劑，提取時(shí)間30 min，料液比1∶40 g·mL-1，不同提取溫度對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同提取溫度對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響

以超純水為提取溶劑，提取溫度為檢測(cè)結(jié)果最優(yōu)的50 ℃ ，料液比1∶40 g·mL-1，不同提取時(shí)間對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取時(shí)間對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響

以超純水為提取溶劑，提取溫度為檢測(cè)結(jié)果最優(yōu)的50 ℃，提取時(shí)間為檢測(cè)結(jié)果最優(yōu)的15 min，不同料液比對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選提取工藝在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，研究提取溫度、提取時(shí)間、料液比對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響。實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

由表5可知，各因素對(duì)夜來(lái)香根莖中多糖得率的影響按大小依次排列，分別是提取溫度、料液比、提取時(shí)間。多糖最佳提取工藝組合是A3B3C2，即提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間為35 min，料液比為1∶40 g·mL-1，此工藝組合提取的夜來(lái)香根莖多糖含量最高。

表3 不同料液比對(duì)夜來(lái)香根莖多糖得率的影響

表4 因素與水平表

表5 多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.5多糖提取的方法學(xué)考察

2.5.1精密度考察精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液2.5 mL進(jìn)行顯色，顯色完成后立即連續(xù)6次測(cè)定溶液的吸光度，葡萄糖對(duì)照品吸光值RSD 0.32%，說(shuō)明儀器精密度良好，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.5.2穩(wěn)定性考察稱取夜來(lái)香根莖粉末0.5 g，按照優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行提取顯色，顯色完成后立即測(cè)定吸光度，之后每隔10 min測(cè)一次吸光度，考察70 min內(nèi)夜來(lái)香根莖多糖的穩(wěn)定性。夜來(lái)香根莖供試品顯色后在20～70 min內(nèi)吸光值RSD 0.26%，說(shuō)明供試品顯色后在20～70 min內(nèi)保持穩(wěn)定，因此，測(cè)定吸光度的時(shí)間為顯色后的20 min，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 精密度考察結(jié)果

表7 穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.5.3重復(fù)性考察稱取夜來(lái)香根莖粉末0.5 g，按照優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行提取顯色，顯色完成后立即測(cè)定吸光度，重復(fù)試驗(yàn)6次，RSD 1.42%，說(shuō)明此方法重復(fù)性良好，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 重復(fù)性考察結(jié)果

2.5.4加樣回收試驗(yàn)稱取夜來(lái)香根莖粉末0.5 g，按照最佳提取工藝進(jìn)行提取，得到夜來(lái)香根莖待測(cè)液。加入和夜來(lái)香根莖多糖含量相當(dāng)?shù)钠咸烟菍?duì)照品溶液，按照顯色方法進(jìn)行顯色，顯色完成后測(cè)定其吸光度，重復(fù)試驗(yàn)6次，計(jì)算得D-葡萄糖的平均加樣回收率為95.36%，加樣回收率的RSD為1.73%，說(shuō)明此方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

在本實(shí)驗(yàn)中，超聲波輔助提取該屬的多糖，充分利用強(qiáng)烈的振動(dòng)、空化和超聲波粉碎，提高該屬多糖的提取率。超聲波輔助提取與目前的其他多糖提取方法比較，不失為一種簡(jiǎn)單還高效的方法，不僅可以降低提取時(shí)間還可以減少提取成本。同時(shí)可以適當(dāng)降低提取溫度，即使提取溫度比較低也能達(dá)到較高的多糖提取率，可以防止多糖的結(jié)果受高溫破壞。超聲波提取多糖的方法，作為一種良好的提取多糖的方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于天然植物中有效成分的提取。另一方面，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還可以獲得從該屬的多糖超聲提取多糖的最佳方法；采用最優(yōu)工藝進(jìn)行操作，夜來(lái)香根莖多糖得率為18.67%。