基于Cyt-B基因鑒定肉制品中鴨源性成分的研究

劉玟妍，陳思秀，王天添，段思琪，艾金霞，王艷雙，孫麗媛，*

（1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林吉林132013；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林吉林132013）

肉及肉制品是人類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)必需品，滿(mǎn)足人體26%的蛋白質(zhì)和13%的能量需要[1]。金萍等[2]檢驗(yàn)涉及32個(gè)生產(chǎn)單位的90 份樣品，總不符合率為25.6%（23/90），主要以豬肉、鴨肉部分代替牛肉和羊肉；唐穗平等[3]抽樣調(diào)查的50 份市售肉類(lèi)制品中20%摻假，摻假源為雞、鴨、豬3 種肉類(lèi)。這些問(wèn)題的出現(xiàn)嚴(yán)重干擾了我國(guó)畜肉產(chǎn)業(yè)，制約了肉品質(zhì)量的提升，并嚴(yán)重?fù)p害了消費(fèi)者的權(quán)益。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]明確說(shuō)明了食品添加劑的使用原則，食品添加劑不得掩蓋食品腐敗變質(zhì)，不得掩蓋食品本身或者加工過(guò)程中的質(zhì)量缺陷，不得以摻雜、摻假、偽造為目的而使用等。由于無(wú)法直接通過(guò)肉眼和味覺(jué)鑒別，因此，亟待建立一種特異性高、靈敏度強(qiáng)、高效快速的方法鑒別肉類(lèi)產(chǎn)品中的鴨源性成分。

傳統(tǒng)肉類(lèi)鑒別方法主要依賴(lài)于形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)。但形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)具有局限性，屬于主觀(guān)判斷，缺乏客觀(guān)技術(shù)指標(biāo)，準(zhǔn)確性欠佳，不適用于肉類(lèi)加工產(chǎn)品的鑒別。目前，國(guó)內(nèi)外開(kāi)展肉種鑒別的方法主要包括基于代謝物的拉曼散射光譜和紅外吸收光譜技術(shù)[5-7]、基于抗體抗原的酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)[8-9]、基于核酸的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)[10-11]等。拉曼光譜的靈敏度較低，待測(cè)物需要較高的含量才可檢測(cè)。近紅外光譜法需要大量有代表性且測(cè)量值已知的樣品建立模型，但模型不通用限制它的使用范圍[12]。ELISA 技術(shù)容易受制于抗體的制備，加工過(guò)程蛋白質(zhì)變性，復(fù)雜基質(zhì)導(dǎo)致假陽(yáng)性[13]。DNA 比蛋白質(zhì)的耐熱性強(qiáng)，高溫處理過(guò)的肉類(lèi)中仍能提出片段化的DNA，而且DNA 比蛋白質(zhì)具有更豐富的種間多態(tài)性，更有利于物種鑒別[14]。近幾年新興的電子鼻和電子舌技術(shù)[15-17]雖然具有操作方便、成本低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，但分析過(guò)程復(fù)雜，不適用于無(wú)相關(guān)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員檢測(cè)。因此，PCR方法的應(yīng)用更為廣泛，也是現(xiàn)行國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中指定的主要方法之一，其操作簡(jiǎn)便，可實(shí)現(xiàn)定性檢驗(yàn)和高通量篩選。目前應(yīng)用于動(dòng)物源性成分鑒別的PCR 方法包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time PCR）[18-19]技術(shù)、數(shù)字PCR 技術(shù)[20-21]等。但此類(lèi)技術(shù)所需的儀器及配件產(chǎn)品價(jià)格昂貴，過(guò)程較為復(fù)雜，對(duì)試驗(yàn)操作要求較高，這些不足限制了將此研究結(jié)果轉(zhuǎn)化為常見(jiàn)肉類(lèi)產(chǎn)品DNA 鑒定試劑盒的可能性。

由于動(dòng)物的線(xiàn)粒體DNA 種屬特異性強(qiáng)，且在同一個(gè)體的不同組織無(wú)差異[22]，同時(shí)線(xiàn)粒體DNA 在每個(gè)細(xì)胞中都存在高拷貝數(shù)，即使肉品經(jīng)高溫等深加工處理后仍能被檢出，因此常被作為分子標(biāo)記的靶基因[23]。本研究以鴨及其他常見(jiàn)動(dòng)物（牛、羊、豬、雞、驢）的Cyt-B基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)并篩選特異性引物，應(yīng)用PCR 技術(shù)對(duì)肉制品中鴨源性成分進(jìn)行檢測(cè)并克隆構(gòu)建了目的基因的重組質(zhì)粒，為肉類(lèi)產(chǎn)品DNA 鑒定試劑盒的研發(fā)提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

試驗(yàn)用鴨、牛、羊、豬、雞、驢6 種生鮮肉由長(zhǎng)春食品藥品檢測(cè)中心提供及本地市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 主要儀器和試劑

1.2.1 主要儀器

Q6000 核酸蛋白分析儀：美國(guó)Quawell；9700 型PCR 擴(kuò)增儀：美國(guó)ABI 公司；JY-600C 型雙穩(wěn)定時(shí)電泳儀：北京市君意東方電泳設(shè)備有限公司；UVWHITE-2020D 紫外凝膠成像自動(dòng)分析儀：美國(guó)Cold Spring 公司；GL-20G-Ⅱ型變速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；JD100-3B 電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子有限公司。

1.2.2 主要試劑

Tris-HCl：GENVIEW；10 %十二烷基硫酸鈉：BIOSHARP；飽和乙酸鈉溶液：天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站；異丙醇：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；70%冰凍酒精：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；2×Taq PCR MasterMix、100 bp Ladder Marker：天根生化科技（北京）有限公司。

吉林省中藥DNA 指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)室自行研制改良十二烷基硫酸鈉法動(dòng)物組織DNA提取試劑盒P1～P7（P1～P3 是細(xì)胞消化液，P4～P5 是DNA 沉淀劑，P6 是DNA 洗滌劑，P7 是DNA 溶解液）。

2 方法

2.1 PCR 引物設(shè)計(jì)

從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)獲取鴨、牛、羊、豬、雞、驢物種的Cyt-B 基因序列；采用DNAStar 等相關(guān)軟件進(jìn)行序列比較，找出同源性較高的區(qū)域[24]，在該區(qū)域內(nèi)選擇引物設(shè)計(jì)的模板；使用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物；最后用BLAST 進(jìn)行比對(duì)。引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。特異性引物序列見(jiàn)表1。

表1 特異性引物序列Table 1 Sequences of specific primers

2.2 改良十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）堿變性法[25]提取DNA

高質(zhì)量DNA 的快速提取是決定分子生物學(xué)試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素。常規(guī)SDS 法不能很好地將雜質(zhì)去除干凈，影響后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)結(jié)果。故本實(shí)驗(yàn)室（吉林省中藥DNA 指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心）自行研發(fā)了改良SDS 法動(dòng)物組織DNA 提取試劑盒，具體操作步驟如下：

將試驗(yàn)樣品進(jìn)行分類(lèi)標(biāo)記，取50 mg 左右樣品放入無(wú)菌EP（eppendorf）管中，加約1 mL 冷生理鹽水溶液浸泡20 min，去除生理鹽水，再浸泡，可反復(fù)2 次～3 次；然后盡量去除生理鹽水，用小型組織勻漿機(jī)點(diǎn)式研磨（上述操作盡量在冰盒上進(jìn)行，以防止DNA 降解）。4 ℃，10 000r/min 離心5 min，棄上清液。取處理樣品20 mg，置于離心管中；加入P1 溶液500 μL，P2 溶液30 μL，P3 溶液15 μL 混勻，置于56 ℃水浴振蕩1 h；取出后加入P4 溶液500 μL，充分混勻10 min，10 000r/min 離心10 min；取上清液加入等體積P5 溶液，-20 ℃放置1 h；10 000 r/min 離心10 min；棄上清液，沉淀中加入P6 溶液200 μL，混勻，11 000 r/min 離心10 min，重復(fù)離心1 次；棄上清液，沉淀室溫（25 ℃）晾干后，加入P7 溶液100 μL 溶解DNA，輕輕混勻，作為試驗(yàn)樣本DNA 儲(chǔ)存液，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肉樣DNA 基因組濃度和純度檢測(cè)

DNA 鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在260 nm 處，當(dāng)DNA 樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA 吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。用核酸測(cè)定儀分別測(cè)定各個(gè)樣品的OD260、OD280，計(jì)算其比值衡量樣品的純度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。將得到的DNA 原液稀釋到約100 ng/μL，-20 ℃保存。

2.4 確立PCR 反應(yīng)體系及條件

反應(yīng)體系：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上下游引物（10 ng/μL）各0.5 μL，DNA 模板0.5 μL，二次蒸餾水8.5 μL，共20 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

2.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

制備1.5%的瓊脂糖凝膠（瓊脂糖1.2 g，1×Tris-硼酸緩沖液80 mL），待所有瓊脂糖均完全融化，液體澄清，加入GelRed 7 μL。膠冷卻后4 μL 點(diǎn)樣。在電壓85 V，電流60 mA 的條件下電泳80 min。

2.6 特異性試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)各引物PCR 特異性，在一批次PCR 反應(yīng)中同時(shí)對(duì)目標(biāo)物種和其他參考物種進(jìn)行檢測(cè)。一組加入鴨、牛、羊、豬、雞、驢模板及各自引物作為陽(yáng)性對(duì)照組（引物及模板量提升至1 μL，以二次蒸餾水補(bǔ)齊至20 μL），另一組加入鴨、牛、羊、豬、雞、驢模板及所設(shè)計(jì)的鴨特異性引物作為試驗(yàn)組。同時(shí)將鴨肉與牛肉1 ∶1 質(zhì)量比混合提取DNA、鴨肉與羊肉1 ∶1 質(zhì)量比混合提取DNA 制備鴨?；旌夏Ｐ秃网喲蚧旌夏Ｐ?，與前文方法相同設(shè)立對(duì)照組和試驗(yàn)組。瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.7 靈敏度試驗(yàn)

檢測(cè)體系的靈敏度是指該檢測(cè)體系可以進(jìn)行穩(wěn)定檢測(cè)的最低質(zhì)量濃度。本試驗(yàn)將制備的鴨肉樣的DNA 模板（100 ng/μL）倍比稀釋?zhuān)来螢?×102、1×101、1×100、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5ng/μL，每個(gè)稀釋度各取2 μL 作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，同時(shí)以雙蒸水代替DNA 模板設(shè)置陰性對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.8 PCR 產(chǎn)物克隆

凝膠回收：切取特異性試驗(yàn)得到的瓊脂糖凝膠中鴨的條帶（對(duì)照組及試驗(yàn)組），稱(chēng)取重量為0.398 g，使用TIANgel Midi Purification Kit（普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒）對(duì)樣本進(jìn)行凝膠回收。由于后續(xù)做測(cè)序，即使用二次蒸餾水做洗脫液，并用核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的樣品DNA 濃度，鴨為8.8 ng/μL。

質(zhì)粒連接：使用pGM-T 連接試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)粒連接。根據(jù)所測(cè)得的樣品濃度及分子量大小計(jì)算PCR 純化產(chǎn)物的加入量為4 μL。計(jì)算公式如下：

PCR 純化產(chǎn)物的加入量/μL=200×bp 數(shù)/3015×濃度（凝膠回收DNA）

克隆轉(zhuǎn)化：將克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)入到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，加入SOC 培養(yǎng)基增菌，將菌液滴加于LB 固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)菌液平板16 h。

藍(lán)白斑篩選，提質(zhì)粒：挑取白色菌落進(jìn)行細(xì)菌增菌，使用TIANprep Mini Plasmid Kit 質(zhì)粒小提試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)粒提取。由于后續(xù)做測(cè)序，即使用二次蒸餾水做洗脫液，并用核酸測(cè)定儀測(cè)定提取的質(zhì)粒的濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 肉樣DNA 基因組濃度和純度檢測(cè)

不同物種的DNA 純度與濃度結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同物種的DNA 純度與濃度Table 2 Purity and content of DNA from different samples

肉樣DNA 的OD260/OD280均在1.8～2.0 之間，DNA濃度在140 ng/μL～370 ng/μL 之間。

3.2 特異性試驗(yàn)

應(yīng)用設(shè)計(jì)的鴨特異性引物進(jìn)行試驗(yàn)，鴨引物PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 鴨引物PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR specificity amplification of the primers for duck

由圖1 可知，僅鴨肉DNA 模板能擴(kuò)增出大小為512 bp 的目的片段，其余肉類(lèi)樣本DNA 模板擴(kuò)增均為陰性。

鴨?；旌夏Ｐ蚉CR 特異性擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 鴨?；旌夏Ｐ蚉CR 特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR specificity amplification for a mixed model of duck and cattle

由圖2 可知，鴨肉與牛肉DNA 模板均擴(kuò)增出大小為512 bp 和256 bp 目的片段。

鴨羊混合模型PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 鴨羊混合模型PCR 特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR specificity amplification for a mixed model of duck and sheep

由圖3 可知，鴨肉與羊肉DNA 模板均擴(kuò)增出大小為512 bp 和317 bp 目的片段。

3.3 靈敏度試驗(yàn)

將制備的鴨肉DNA 模板用二次雙蒸水10 倍梯度稀釋?zhuān)觅|(zhì)量濃度0.000 001 ng/μL～100 ng/μL，取2 μL為模板。鴨源性DNA 靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 鴨源性DNA 靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test of duck derived DNA

由圖4 可知，PCR 擴(kuò)增后，當(dāng)反應(yīng)體系中含鴨源性DNA 成分0.000 01 ng/μL 時(shí)，可觀(guān)察到目的條帶。

3.4 克隆結(jié)果測(cè)序分析

克隆質(zhì)粒PCR 電泳結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 克隆質(zhì)粒PCR 電泳結(jié)果Fig.5 PCR electrophoresis of cloning plasmid

由圖5 可知，克隆結(jié)果與預(yù)期目的條帶位置一致。

鴨特異性基因片段克隆產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖6。

由圖6 可知，目的片段經(jīng)測(cè)序后，在NCBI 上BLAST 結(jié)果表明該片段的核苷酸序列與GeneBank 中已登記的鴨物種（EU755253.1）相似性均為100%，證明所得克隆的DNA 片段即為目的基因片段。

圖6 鴨特異性基因片段克隆產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)結(jié)果Fig.6 Sequencing comparison results of cloned products of duck specific gene fragment

4 結(jié)論與討論

本研究根據(jù)Cyt-B 基因中的保守序列設(shè)計(jì)鴨的特異性引物，擴(kuò)增片段大小為512 bp，優(yōu)化PCR 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，確定退火溫度，PCR 結(jié)果通過(guò)凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行顯現(xiàn)。特異性試驗(yàn)中僅有以鴨的DNA 為模板擴(kuò)增出了特異性條帶，其他肉類(lèi)均無(wú)相應(yīng)條帶，結(jié)果為陰性，混合模型的特異性試驗(yàn)同時(shí)擴(kuò)增出了鴨與混合其他肉種樣品的特異性條帶，表明設(shè)計(jì)的引物特異性強(qiáng)，能夠檢測(cè)出肉制品中鴨源性成分。目前用于動(dòng)物源性成分檢測(cè)的PCR 方法都十分敏感，DNA 檢測(cè)的靈敏度達(dá)到了pg 級(jí)[26]，本檢測(cè)體系可以對(duì)鴨肉含量為1 pg 的肉制品實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定檢測(cè)，與范麗麗等[27]建立的針對(duì)豬肉熒光PCR 檢測(cè)體系靈敏度（1 pg）及許如蘇等[28]建立的針對(duì)4 種動(dòng)物多重?zé)晒釶CR 檢測(cè)體系靈敏度（0.01%）結(jié)果相同。目前，本研究正應(yīng)用于市售牛、羊肉樣品中鴨源性成分摻假的檢測(cè)。

為了使分子生物學(xué)方法鑒定肉類(lèi)真?zhèn)卧诨鶎訌V泛推廣，須有穩(wěn)定的陽(yáng)性對(duì)照品。非官方購(gòu)買(mǎi)的樣品需鑒定真?zhèn)?，而長(zhǎng)期從食品藥品監(jiān)督局購(gòu)買(mǎi)陽(yáng)性對(duì)照品又會(huì)造成經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，且肉類(lèi)容易變質(zhì)，不利保存。本研究克隆構(gòu)建了目的基因的重組質(zhì)粒，測(cè)序分析結(jié)果表明克隆的特異性基因序列與Genbank 中相同物種（序列ID：EU755253.1）核苷酸同源性達(dá)100%，可作為陽(yáng)性對(duì)照用于鑒定動(dòng)物源性產(chǎn)品中鴨肉成分，同時(shí)也為常見(jiàn)肉類(lèi)產(chǎn)品DNA 鑒定試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。