高效液相色譜法測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2含量

黃偉志，黃桂東，鐘先鋒

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山528231）

功能性飲料，是指飲料中添加維生素、氨基酸、膳食纖維等各種功能性成分，從而使其具有保健功效[1]。隨著消費(fèi)者保健意識(shí)增強(qiáng)和運(yùn)動(dòng)需求增加，功能性飲料增長迅速。未來五年，功能飲料市場預(yù)計(jì)復(fù)合增長率將超過12%[2]。

維生素B1、維生素B2是部分功能性飲料的主要有效成分。維生素B1，即硫胺素（thiamine），是機(jī)體代謝不可缺少的一種水溶性維生素。硫胺素主要貯存在細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的三羧酸循環(huán)（細(xì)胞有氧代謝的核心環(huán)節(jié)）和磷酸戊糖途徑代謝（能量代謝與細(xì)胞的脂質(zhì)及核酸代謝）[3-4]。運(yùn)動(dòng)后，適當(dāng)補(bǔ)充含維生素B1的功能性飲料可減少丙酮酸、乳酸堆積，減少運(yùn)動(dòng)后疲勞的產(chǎn)生，提高耐力運(yùn)動(dòng)能力[5-6]。維生素B2，即核黃素（riboflavin），是黃素輔酶的主要成分，直接參與機(jī)體復(fù)雜的生物氧化過程[7]。一般情況下，人體能夠從飲食中獲取維持正常生理機(jī)能所需的核黃素，但在運(yùn)動(dòng)過渡情況下會(huì)引起機(jī)體內(nèi)核黃素的丟失，而且運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的自由基損傷和氧化損傷涉及全身許多器官和組織，影響機(jī)體生長發(fā)育和腦功能，進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)能力[8-9]。

雖然部分功能性飲料添加有維生素B1、維生素B2等功效成分，能提高人體運(yùn)動(dòng)能力，但是根據(jù)我國GB 24154-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品通則》對運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)食品可添加的營養(yǎng)素中維生素B1、維生素B2規(guī)定分別限定在0.2 mg~4 mg、0.2 mg~2 mg（以每日計(jì)），因此功能性飲料中不能過量添加維生素B1、維生素B2。目前測定維生素B1、維生素B2的方法主要包括熒光分光光度計(jì)法[10]、高效液相色譜法[11-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15]等，而較多實(shí)驗(yàn)室主要依據(jù)GB 5009.84-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素B1的測定》、GB 5009.85-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中維生素B2》兩種方法單一測定，較少建立同時(shí)測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2的方法，單一測定檢測耗時(shí)長、效率低，不能滿足多種檢測的需求。

鑒此，本文以功能性飲料中含有的維生素B1、維生素B2為檢測對象，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法進(jìn)行梯度洗脫及優(yōu)化檢測方法，并對建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證分析，以期建立可以同時(shí)測定維生素B1、維生素B2含量的方法，提高實(shí)驗(yàn)室分析檢測效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

維生素B1、維生素B2（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；乙腈：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸：永華化學(xué)科技（江蘇）有限公司；鹽酸：利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司；氫氧化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

1220 高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；Milli-Q 超純水系統(tǒng)：Millipore 公司；Vortex-Genie 2 渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ300E 超聲波清洗器：上海精密儀器儀表有限公司；SHZ-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液及標(biāo)準(zhǔn)品的配制

1.2.1.1 溶液的配制

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16-17]的方法，進(jìn)行配制0.1%三氟乙酸溶液、0.5 mol/L 鹽酸溶液、0.1 mol/L 鹽酸溶液及2 mol/L 氫氧化鈉溶液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

根據(jù)參考文獻(xiàn)[17]的方法進(jìn)行配制維生素B1、維生素B2的標(biāo)準(zhǔn)品。

1）維生素B1標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的制備：準(zhǔn)確稱取維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品0.080 0 g，加0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解，超聲15 min，待全部溶解后，用0.1 mol/L 鹽酸溶液定容至50 mL 棕色容量瓶中。該標(biāo)準(zhǔn)貯備中維生素B1的濃度為1 600 μg/mL。

2）維生素B2標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液的制備：準(zhǔn)確稱取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品0.040 0 g，加2.5 mL 的2 mol/L 氫氧化鈉溶液溶解，超聲待全部溶解后，加30 mL 水，再加1.2 mL冰乙酸，用水定容至50 mL 棕色容量瓶中。該標(biāo)準(zhǔn)貯備中維生素B2的濃度為800 μg/mL。

3）混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別準(zhǔn)確移取維生素B1、維生素B2標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液10.00 mL 于同一100 mL 棕色容量瓶中，用0.1%三氟乙酸溶液定容。該溶液中維生素B1、維生素B2濃度分別為160、80 μg/mL。

吸取0、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL 棕色容量瓶中，用0.1 %三氟乙酸溶液定容至10 mL，得到混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中維生素B1溶度為0、4、8、16、40、80 μg/mL；維生素B2濃度為0、2、4、8、20、40 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)品及樣品處理：吸取2 mL 標(biāo)準(zhǔn)品液、樣品液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，待進(jìn)樣。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）流速：1.0mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；波長：280 nm；檢測器：紫外檢測器（UV-detector）；流動(dòng)相：A 為0.1 mol/L 三氟乙酸溶液，B 為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密吸取1.2.1.2 中的維生素B1、維生素B2混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照1.2.2 進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度（X）為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)峰面積值（Y）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 檢出限和定量限

將維生素B1、維生素B2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度稀釋后分別進(jìn)樣檢測，以信噪比S/N=3 時(shí)的進(jìn)樣溶液濃度為最低檢測濃度，即檢出限（limit of determination，LOD）；以信噪比S/N=10 時(shí)的進(jìn)樣溶液濃度為最低定量濃度，即定量限（limit of quantification，LOQ）。

1.2.5 精密度和回收率

隨機(jī)抽取6 份同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品（維生素B1：16 μg/mL；維生素B2：8 μg/mL）連續(xù)進(jìn)樣6 次，以峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）來表征儀器的精密度。

采用已知維生素B1、維生素B2含量的樣品進(jìn)行加標(biāo)，以0.5、1.0、1.5 倍的3 個(gè)水平加標(biāo)試驗(yàn)，以外標(biāo)法計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD，每個(gè)濃度值重復(fù)進(jìn)樣3 次。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試樣品溶液，在室溫25 ℃條件下存放，每相隔24 h，按照1.2.2 方法進(jìn)行試樣測定，連續(xù)測定3 d。

1.2.7 樣品測定

通過建立的HPLC 法對市場上2 種功能性維生素飲料中維生素B1、維生素B2含量進(jìn)行測定，樣品平行測定2次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

色譜數(shù)據(jù)分析采用儀器自帶軟件Agilent Chem－Station 進(jìn)行處理。所有線性方程、精密度及回收率試驗(yàn)的數(shù)據(jù)均由WPS Excel 2016 處理得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

參考張憬等[18]和張媛媛等[19]測定維生素B 的方法，得出246、267、280 nm 3 個(gè)理想波長數(shù)據(jù)，經(jīng)過檢測發(fā)現(xiàn)，在280 nm 條件下同時(shí)測定維生素B1、維生素B2，基線穩(wěn)定，組分出峰理想，故選擇280 nm 波長采集數(shù)據(jù)。

經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研[20]，高效液相中比較常用的流動(dòng)相一般為0.1%三氟乙酸（調(diào)節(jié)pH 值）-乙腈或甲醇-磷酸鹽緩沖溶液，但由于甲醇-磷酸鹽緩沖溶液體系中鹽濃度較高，如果試驗(yàn)后不及時(shí)沖洗色譜柱會(huì)出現(xiàn)結(jié)晶，容易造成色譜柱堵塞，且對儀器要求較高，所以出于保護(hù)色譜柱，選用0.1%三氟乙酸-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)過程中樣品出峰時(shí)間短，并且峰形分離度高且對稱，無拖尾峰。

根據(jù)文獻(xiàn)[21]調(diào)研和考慮柱壓對色譜柱使用壽命的影響，在實(shí)際試驗(yàn)操作中確定高效液相色譜的流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 維生素B1、維生素B2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

維生素B1、維生素B2混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，從低濃度到高濃度分別注入高效液相色譜儀，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制維生素B1、維生素B2的工作曲線如圖1，并計(jì)算回歸方程。結(jié)果得出維生素B1、維生素B2的線性方程分別為Y=8.145 9X+0.318 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 98；Y=30.785X+0.121 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 99；表明維生素B1濃度在0~80 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，維生素B2濃度在0~40 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 維生素B1、維生素B2 檢出限和定量限

通過一系列梯度稀釋后，確定了維生素B1、維生素B2的檢出限分別為0.002 8、0.000 60 μg/mL，定量限分別為0.009 2、0.001 8 μg/mL，說明本檢測方法靈敏度較高。

2.4 精密度和回收率

通過對6 份同濃度的維生素B1、維生素B2混合標(biāo)準(zhǔn)品（維生素B1：16 μg/mL；維生素B2：8 μg/mL）連續(xù)進(jìn)樣6 次，其峰面積及精密度見表2。

由表2 可知，維生素B1、維生素B2的RSD 分別為0.50%、0.77%，說明此法精密度較好，可適用于同時(shí)測定維生素B1、維生素B2。

通過對已知維生素B1、維生素B2含量的樣品進(jìn)行加標(biāo)，向已知樣品維生素B1加入0.60、1.20、1.80 mg/100 mL低、中、高3 個(gè)不同濃度的維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品，向已知樣品維生素B2加入0.34、0.68、1.02 mg/100 mL 低、中、高3 個(gè)不同濃度的維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品，以外標(biāo)法計(jì)算，其加標(biāo)回收率和RSD 見表3。

表3 加標(biāo)回收率測試結(jié)果Table 3 Results of recoveries

由表3 可知，回收率在94.12 %~98.53 %之間，RSD 在0.32%~0.84%之間，說明此法重現(xiàn)性較好，可以被推廣。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

通過對同一供試樣品溶液，在室溫25℃條件下存放，每相隔24 h，連續(xù)測定3 d，其檢測含量RSD 見表4。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)Table 4 The reproducibility experiments

續(xù)表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)Continue table 4 The reproducibility experiments

由表4 可知，樣品中維生素B1、維生素B2的檢測含量RSD 分別在4.67 %~5.86 %、0~1.64 %，平均值RSD 分別為0.47%、0.82%，說明供試樣品溶液在室溫25 ℃條件下放置3 d 后，樣品成分含量穩(wěn)定，檢測方法準(zhǔn)確可靠。

2.6 樣品測定

為了考察此方法的實(shí)用性，隨機(jī)對2 種功能性維生素飲料進(jìn)行了分析，結(jié)果如表5 所示。

表5 樣品測定結(jié)果Table 5 The results of sample

由表5 可知，該方法同時(shí)測定維生素B1、維生素B2的相對偏差在1%~5%，說明檢測結(jié)果與實(shí)測結(jié)果較為接近，能滿足同時(shí)測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2含量的要求。

維生素B1、維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見圖2。

由圖2 可知，標(biāo)準(zhǔn)品中維生素B1、維生素B2的保留時(shí)間分別在2.620、10.108 min，樣品1 中維生素B1、維生素B2的保留時(shí)間分別在2.573、10.160 min，樣品2 中維生素B1、維生素B2的保留時(shí)間分別在2.641、10.331 min，表明本試驗(yàn)建立的方法能確保使樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中的檢測物質(zhì)出峰時(shí)間相一致，偏差較少，建立的方法較好。

3 結(jié)論

目前中國逐步成為全球最大的飲料市場，不僅展現(xiàn)了巨大的發(fā)展?jié)摿?，更遑論未來的發(fā)展勢頭，而其中功能飲料和健康飲料將發(fā)揮更大的發(fā)展空間。市場上功能性飲料成分呈現(xiàn)多種多樣，單一成分檢測難以滿足現(xiàn)今實(shí)驗(yàn)室檢測要求，因此本試驗(yàn)通過建立高效液相色譜法同時(shí)測定功能性飲料中的維生素B1、維生素B2含量的方法，提高實(shí)驗(yàn)室分析檢測效率。對色譜條件進(jìn)行了試驗(yàn)及優(yōu)化驗(yàn)證，以C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）為分離柱，用0.1%三氟乙酸和乙腈以不同比例混合進(jìn)行梯度淋洗，使用紫外檢測器在280 nm處測定。結(jié)果表明，維生素B1、維生素B2的質(zhì)量濃度分別在0～80 μg/mL、0～40 μg/mL 范圍內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，R2分別為0.999 98、0.999 99，線性關(guān)系較好；檢測方法的精密度RSD 分別為0.50%、0.77%；樣品加入標(biāo)準(zhǔn)品后測得回收率分別在94.17 %～97.78 %、94.12%～98.53%之間，方法的最低檢出限分別為0.002 8、0.000 60 μg/mL，定量限分別為0.009 2、0.001 8 μg/mL；最后通過抽取兩個(gè)樣品進(jìn)行檢測驗(yàn)證，結(jié)果得出檢測相對偏差分別在2%～5%、1%～5%，檢測結(jié)果與實(shí)測結(jié)果較為接近，能滿足同時(shí)測定功能性飲料中維生素B1、維生素B2含量的要求。

圖2 維生素B1、維生素B2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of standard and sample of vitamin B1 and vitamin B2