甜米酒酒曲微生物分離和菌種鑒定

蔡海鶯，張婷，沈靈智，彭佩瑩，戴璟，張琪，羅潔，毛克羽，蔡成崗，毛建衛(wèi)，*

（1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江科技學(xué)院，浙江杭州310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江杭州310023）

甜米酒是我國(guó)的傳統(tǒng)酒種，歷史悠久，主要以?xún)?yōu)質(zhì)糯米為原料，在自然環(huán)境中通過(guò)微生物混合發(fā)酵而成。米酒柔和綿長(zhǎng)，香氣宜人，是我國(guó)百姓飲食文化中必不可少的部分。我國(guó)南方大米產(chǎn)區(qū)素有在家釀造獨(dú)特風(fēng)味米酒的傳統(tǒng)[1]。另外，米酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值同樣引人關(guān)注，除原料自身營(yíng)養(yǎng)成分外，還包含米酒傳統(tǒng)釀制過(guò)程中產(chǎn)生的低聚糖、多肽、氨基酸、維生素等易于被人體消化吸收成分[2]。甜米酒雖然功效眾多，但國(guó)內(nèi)甜米酒市場(chǎng)整體呈現(xiàn)產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，市場(chǎng)規(guī)模不大，強(qiáng)勢(shì)領(lǐng)導(dǎo)品牌較少，缺乏產(chǎn)品和技術(shù)創(chuàng)新等。米酒的釀制為多種微生物混合自然發(fā)酵的過(guò)程，酒曲為發(fā)酵過(guò)程中微生物的主要來(lái)源。酒曲起源約6000 年以前的中國(guó)，最早的文字記載可追溯到1700 多年前北魏賈思勰的《齊民要術(shù)》[3]。

我國(guó)傳統(tǒng)酒曲的制作受使用原料、空氣溫度和濕度、環(huán)境微生物等多種因素的影響，酒曲穩(wěn)定性很難保證。微生物菌種可謂發(fā)酵的靈魂，酒曲中微生物多樣性和數(shù)量以及微生物互作等對(duì)米酒最終的質(zhì)量、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)功能都有著重要影響[4-5]。不穩(wěn)定的酒曲意味著發(fā)酵米酒品質(zhì)和風(fēng)格也無(wú)法穩(wěn)定，因?yàn)槔米匀唤绶N類(lèi)和性質(zhì)未知的微生物進(jìn)行發(fā)酵，技術(shù)流程的標(biāo)準(zhǔn)化難以實(shí)現(xiàn)，同時(shí)未知菌種還可能帶來(lái)食品安全上的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此，獲得安全和穩(wěn)定性高甜米酒酒曲是發(fā)展甜米酒產(chǎn)業(yè)化道路的必經(jīng)之路。隨著科技水平的飛速發(fā)展，對(duì)酒曲微生物在傳統(tǒng)米酒的發(fā)酵過(guò)程、微生物功能的認(rèn)識(shí)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，包括酵母酒化、酵母生香、根霉的糖化作用、紅曲霉增強(qiáng)酯化作用以及厭氧異養(yǎng)菌、己酸菌、乳酸菌等的米酒風(fēng)味形成作用等[7-9]，均表明酒曲微生物對(duì)米酒風(fēng)味和風(fēng)格的形成以及米酒的功能營(yíng)養(yǎng)有著重要作用。然而，人們對(duì)甜米酒酒曲微生物的分離鑒定和多樣性的研究仍然較少。

本研究鑒于甜米酒酒曲微生物對(duì)米酒發(fā)酵過(guò)程、功能性、風(fēng)味和生物安全性等的潛在影響，通過(guò)收集來(lái)源不同的酒曲樣品，進(jìn)行細(xì)菌和真菌微生物的分離、形態(tài)學(xué)觀(guān)察和分子生物學(xué)鑒定，對(duì)酒曲微生物進(jìn)行多樣性分析，為甜米酒釀制提供了生物資源的選擇依據(jù)和參考，同時(shí)有利于對(duì)揭示米酒微生物的作用機(jī)制和提高米酒的品質(zhì)、穩(wěn)定性等方面具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒曲分別源于孝感、蘇州、麗水、南寧、黔東、達(dá)州、阜陽(yáng)、岳陽(yáng)和紹興等地，編號(hào)見(jiàn)表1。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DHG-9240A 鼓風(fēng)干燥箱、BPH-9162 恒溫培養(yǎng)箱：上?；厶﹥x器制造有限公司；LDZF-30KB 滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；DYY-6C 電泳儀：北京六一生物科技有限公司；Mastercycler pro 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：艾本德中國(guó)有限公司；Bio-rad Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)伯樂(lè)公司。

表1 米酒酒曲編號(hào)及來(lái)源Table 1 Sources and codes of Chinese sweet rice wine starters

細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、酵母基因組DNA提取試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的配制

魯里亞貝塔尼（luria-bertani，LB）細(xì)菌培養(yǎng)基：0.5 %酵母提取物，1%胰蛋白胨，1%氯化鈉，蒸餾水1 L，121 ℃高壓滅菌20 min。固體LB 培養(yǎng)基：LB 細(xì)菌培養(yǎng)基添加1.5%瓊脂粉。

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，蒸餾水1 L，pH6.0，115 ℃濕熱滅菌20 min。固體培養(yǎng)基：對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中添加1.5%瓊脂粉。

1.4 酒曲微生物的分離純化

細(xì)菌和真菌的分離和培養(yǎng)[10]：取12 種酒曲每種樣品1 g，分別溶解于10 mL 滅菌生理鹽水中，依據(jù)樣品菌含量調(diào)整稀釋倍數(shù)，取終濃度是10-3、10-4、10-5g/mL 和10-6g/mL 的酒曲樣品溶液0.1 mL，均勻涂布于LB 和YPD 培養(yǎng)基（YPD 含終濃度0.1 mg/L 四環(huán)素和鏈霉素）培養(yǎng)皿上，分別用于細(xì)菌和真菌微生物的分離和培養(yǎng)。將涂布好的LB 和YPD 培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，分別置于37 ℃和28 ℃，細(xì)菌培養(yǎng)1 d~2 d，真菌培養(yǎng)2 d~4 d。挑取培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的單菌落，轉(zhuǎn)移到相對(duì)應(yīng)的新LB 和YPD 培養(yǎng)皿中分離純化培養(yǎng)，分離的單菌落轉(zhuǎn)移到LB 和YPD 液體培養(yǎng)基，分別在37 ℃和28 ℃，200 r/min 搖床培養(yǎng)16 h 和24 h，直到培養(yǎng)液完全渾濁。

1.5 細(xì)菌和真菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

細(xì)菌菌種DNA 提取采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒。細(xì)菌采用16S rRNA 基因片段進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。細(xì)菌菌株16S rDNA 序列擴(kuò)增：16S rRNA 基因片段擴(kuò)增采用通用引物27F 和1492R[11]：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR 擴(kuò)增以菌株提取的細(xì)菌基因組DNA 為模板，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）條件：正向和反向引物各2 μL、模板DNA 1 μL、高保真DNA 聚合酶KOD 2 μL、10 倍酶緩沖液5 μL 和超純水38 μL。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性0.5 min，72 ℃延伸1min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃末端補(bǔ)齊延伸10 min。

真菌菌種DNA 提取采用酵母基因組DNA 提取試劑盒。真菌采用rRNA 基因ITS 序列片段進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。ITS 擴(kuò)增引物為ITS1 和ITS4[12]：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。PCR 擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序同細(xì)菌16S rRNA 片段PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增效率用1%的瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，將目的片段送至江蘇金維智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 微生物多樣性系統(tǒng)發(fā)育分析

測(cè)序結(jié)果用于微生物多樣性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。將菌株DNA 擴(kuò)增片段序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)在線(xiàn)軟件BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），獲得與目的菌株片段序列相似性較高的細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS 基因序列。進(jìn)一步用MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析分離菌株的種屬及其的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和真菌分離和形態(tài)觀(guān)察

米酒的品質(zhì)、風(fēng)味、安全性和生產(chǎn)效率與酒曲中微生物有重要關(guān)系。本研究從12 種酒曲中分離到46株細(xì)菌和54 株真菌，編號(hào)分別為細(xì)菌bM-N 和真菌M-N（M 分別為12 種酒曲樣品編號(hào)1~12，N 分別為同一樣品中微生物序號(hào)）。甜米酒細(xì)菌和真菌分離種類(lèi)統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 甜米酒細(xì)菌和真菌分離種類(lèi)統(tǒng)計(jì)Table 2 Numbers of bacterialand fungal species isolated from Chinese sweet rice wine

酒曲微生物的分離鑒定結(jié)果表明，從12 種不同來(lái)源的酒曲分離到46 株細(xì)菌和54 株真菌。不同來(lái)源的酒曲微生物種類(lèi)數(shù)量有較大差異，NN5 酒曲分離到14種微生物，BY9 和SS12 也分離到10 種微生物，而XG2 和XG1 僅分別分離到4 種和5 種。根據(jù)培養(yǎng)基來(lái)源、菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀(guān)察，分離的真菌中以酵母為主，少量絲狀真菌，表明甜米酒中的酒精主要來(lái)源于酵母。另外，分離得到的細(xì)菌種類(lèi)與真菌種類(lèi)接近，表明細(xì)菌也在甜米酒釀制過(guò)程中起重要作用，和絲狀真菌一樣，部分細(xì)菌分泌淀粉水解酶系分解淀粉生成葡萄糖，另外，細(xì)菌在該微生態(tài)體系中代謝所產(chǎn)生的酸、酯、醇、酮等物質(zhì)對(duì)米酒的風(fēng)味形成意義重大。然而，酒曲中菌株種類(lèi)的多少和微生物總數(shù)量并無(wú)直接關(guān)系，微生物總數(shù)量主要由種群中優(yōu)勢(shì)菌種的數(shù)量決定，從菌落微生物計(jì)數(shù)結(jié)果表明，XG1、XG2、SS11 和SS12 有較高的菌數(shù)[4]。不同微生物種類(lèi)和組成構(gòu)成的微生物菌群，通過(guò)共生、競(jìng)爭(zhēng)和拮抗等相互關(guān)系調(diào)節(jié)米酒釀制過(guò)程中的微生態(tài)，從而改變了米酒最終的產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味[13-14]。米酒酒曲微生物的鑒定工作由來(lái)已久，最初由于條件的限制，對(duì)米酒中微生物的認(rèn)識(shí)僅限于能夠在實(shí)驗(yàn)室條件下能分離培養(yǎng)的微生物，如李健容等[9]從酒曲中分離了3 類(lèi)酵母菌（酒香酵母屬、假絲酵母屬和畢赤酵母屬）和2 類(lèi)根霉菌（米根霉和華根霉）；研究者還從米酒酒曲中篩選了功能性的微生物，如產(chǎn)γ-氨基丁酸的多種微生物[15]，產(chǎn)凝乳酶的微生物菌株[16]等。隨著生物組學(xué)的發(fā)展，對(duì)米酒釀制過(guò)程中的微生物的認(rèn)識(shí)也更加深入[17-19]，這類(lèi)米酒生物多樣性的研究也為米酒微生物的分離提供了參考。

2.2 細(xì)菌和真菌分子生物學(xué)鑒定

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是篩選微生物資源的重要來(lái)源。通過(guò)分子生物學(xué)特征基因片段的序列比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察，是目前常用的快速菌種鑒定手段。本研究選擇篩選到的46 株細(xì)菌和16 株長(zhǎng)勢(shì)良好的酵母形態(tài)和絲狀真菌的真菌，對(duì)其基因組DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。細(xì)菌16S rRNA 基因V3~V4 區(qū)擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)菌16S rRNA 基因片段PCR 擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of bacterial 16S rRNA gene fragment

由圖1 可知，僅少量菌株沒(méi)有明顯目的條帶，其余41 個(gè)樣品PCR 擴(kuò)增均獲得約1.5 kb 大小的目的片段，用于目的基因測(cè)序。然而，與細(xì)菌不同，真菌中獲得目的基因ITS 序列的PCR 擴(kuò)增條帶的很少，并且擴(kuò)增條帶大小有一定差異，在約0.75 kb 到1.5 kb 之間。其中，2 株擴(kuò)增條帶明顯，14 株顯示有少量擴(kuò)增。表明真菌在DNA 提取和PCR 擴(kuò)增效率較細(xì)菌明顯偏低，可能受到細(xì)胞壁破碎難度較大和真菌自身次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響。對(duì)41 株細(xì)菌和16 株真菌PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得了細(xì)菌16S rRNA 基因V3~V4 區(qū)和真菌18S rRNA 基因ITS 序列。

2.3 進(jìn)化樹(shù)和多樣性分析

DNA 測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST 在線(xiàn)軟件比對(duì)，并用MEGA7 軟件構(gòu)建了酒曲中細(xì)菌和真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。酒曲中分離的芽孢桿菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和其他細(xì)菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2 和圖3。

酒曲微生物中存在大量芽孢桿菌屬（Bacillus），鑒定出的細(xì)菌中有8 株與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis） 同源關(guān)系最近，10 株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）同源關(guān)系最近，3 株與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）同源關(guān)系最近，2 株（b7-2 和b7-3）與萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）同源關(guān)系最近，b4 -3 與地衣形芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）同源關(guān)系最近，1 株（b4-4）與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）同源關(guān)系最近，還有2 株與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）有一定的同源性，還有5 株僅能鑒別到芽孢桿菌屬（Bacillus）。酒曲的制作通常是通過(guò)淀粉含量較高的食品為固體原料（如小麥粉和米飯等），在有氧條件微生物自然發(fā)酵而成。酒曲從有氧環(huán)境富集微生物的這一特性導(dǎo)致酒曲微生物中含有大量芽孢桿菌。然而芽孢桿菌在米酒的釀制過(guò)程中可提供少量淀粉酶和風(fēng)味物質(zhì)前體，在后期酒精濃度較高時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，乳酸菌的含量會(huì)相對(duì)較高[4]。蠟樣芽孢桿菌是常見(jiàn)的腐敗菌，趙東在研究西藏青稞酒酒曲微生物多樣性也鑒定出該菌種[20]。除芽孢桿菌外，酒曲微生物中還分離到溶血性葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus）、阪崎氏腸桿菌（Cronobacter sakazakii）、埃希氏菌屬（Escherichia）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）等的同源微生物，其中溶血性葡萄球菌和肺炎克雷伯菌等均為一定能力的條件致病菌。這一發(fā)現(xiàn)表明酒曲的制作需要嚴(yán)格的管理規(guī)范和制作工藝，防止米酒的發(fā)酵過(guò)程中引入致病菌和腐敗菌，引起食品生物安全性的風(fēng)險(xiǎn)。酒曲中分離的真菌微生物菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4。

圖2 酒曲中分離的芽孢桿菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogentic tree of Bacillus isolated from CSRW starters

圖3 酒曲中分離的其他細(xì)菌菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogentic tree of other bacteria isolated from CSRW starters

圖4 酒曲中分離的真菌微生物菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogentic tree of fungi isolated from CSRW starters

米酒中有豐富的真菌微生物資源。除典型的產(chǎn)酒精微生物釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），還發(fā)現(xiàn)其他產(chǎn)酒精微生物，如庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和米根霉（Rhizopus oryzae）等[21]。另外，扣囊復(fù)膜酵母菌（Saccharomycopsis fibuligera）等非酒精酵母也出現(xiàn)在酒曲微生物中。有報(bào)到表明扣囊復(fù)膜酵母菌可通過(guò)與釀酒酵母的互作和共生影響乙醇的產(chǎn)量，并改變發(fā)酵液中風(fēng)味物質(zhì)的生成[22-23]，未來(lái)對(duì)于非釀酒酵母與釀酒酵母之間的互作機(jī)理研究，有望對(duì)改善和調(diào)節(jié)酒精發(fā)酵飲品提供理論指導(dǎo)。另外，酒曲真菌微生物試驗(yàn)的還鑒定了卷枝毛霉（Mucor circinelloides）和印度毛霉菌（Mucor indicus）的存在。

3 結(jié)論

本研究對(duì)12 種來(lái)源的酒曲進(jìn)行了微生物的分離鑒定，篩選到的46 株細(xì)菌和54 株真菌微生物，結(jié)合菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)一步通過(guò)分子生物學(xué)鑒定快速鑒定了其中41 株細(xì)菌和16 株真菌微生物。酒曲細(xì)菌微生物中含有大量芽孢桿菌；另外，酒曲中還鑒定到少量病原菌和腐敗菌，說(shuō)明部分中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品還有一定的生物安全隱患，需要不斷創(chuàng)新、轉(zhuǎn)型升級(jí)才能迎來(lái)發(fā)酵食品的工業(yè)現(xiàn)代化。酒曲中還有很多真菌微生物資源，通過(guò)分離純化的微生物資源可用于甜米酒酒曲制作和米酒釀制，也可以用于其中發(fā)酵食品的研究開(kāi)發(fā)。經(jīng)過(guò)鑒定的分離微生物的利用，往往可改善發(fā)酵食品的品質(zhì)和風(fēng)味；同時(shí)，科學(xué)的微生物搭配可改善發(fā)酵食品的原料利用效率，還減少了病原菌和腐敗菌對(duì)食品安全性的潛在威脅，是未來(lái)發(fā)酵食品發(fā)酵劑的研究方向之一。