復(fù)合酶法提取鮮玉米皮阿拉伯木聚糖的研究

馬福敏，顧佳

（1.長春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品深加工吉林省教育廳高校重點實驗室，吉林長春130022；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118）

阿拉伯木聚糖（arabinoxylan，AXs）的制備是研究其功能性質(zhì)和廣泛應(yīng)用的前提。目前，產(chǎn)業(yè)化的AXs制備主要采用堿提技術(shù)，環(huán)境污染大，并且該法很容易破壞AXs 分子結(jié)構(gòu)中的阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）等活性基團(tuán)，使AXs 分子的生理活性損失很大[1]。生物技術(shù)特別是酶法提取技術(shù)則因其條件溫和、綠色無污染、能最大限度地回收有效成分，代表了AXs 加工技術(shù)的發(fā)展方向。而酶法提取AXs 存在酶解產(chǎn)物復(fù)雜，分離純化困難等問題[2]，需要對酶法提取進(jìn)行深入的研究。

目前，應(yīng)用酶技術(shù)分離AXs 主要集中在去除淀粉、蛋白等包裹纖維、降低分離純化效率的成分[3]。張曉娜等[4]采用酶法提取麥麩皮中的AXs，并確定了最佳酶解工藝。然而，玉米皮中AXs 的分子上側(cè)鏈的種類、數(shù)量、側(cè)鏈的長度及取代方式較其他谷物中的復(fù)雜，且分子上連接阿魏酸、醋酸及羥基桂皮酸等活性基團(tuán)，會使分子間發(fā)生更為復(fù)雜的氧化交聯(lián)，致使酶分子不易與AXs 接觸，降低酶解效率。目前，關(guān)于玉米皮酶法提取物的研究較少。

本研究采用木聚糖酶Amano HC 90 與纖維素酶Cellulase 復(fù)配，研究復(fù)合酶的比例、復(fù)合酶的添加量等對提取率和提取物中AXs 含量的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鮮玉米麩皮（鮮榨玉米汁副產(chǎn)物）：吉林天景食品有限公司。

D-（+）半乳糖、D-（+）木糖、D-（+）葡萄糖：美國Sigma 公司；阿洛糖：美國Miragen 公司；L-（+）-阿拉伯糖、D-（+）-甘露糖、L-（+）-鼠李糖：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；其他試劑均為分析純。

木聚糖酶Amano HC 90（簡稱HC，由黑曲霉Aspergillus niger 菌株生產(chǎn)，酶活為87 240 U/g）：天野酶制劑（江蘇）有限公司；纖維素酶Cellulase（由Aspergillus niger 菌株生產(chǎn)，酶活力為2 720 U/g）：美國Sigma 公司。

1.2 主要儀器

GC-14C 型氣相色譜儀：日本Shimadzu 公司；HELEOSⅡ型高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）：美國Wyatt 公司；XT5618 型十二聯(lián)平行發(fā)酵系統(tǒng)：匯能達(dá)生物工程設(shè)備有限公司；RE52C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海青浦滬西儀器廠；3K15 型高速冷凍離心機(jī)、Supelco 毛細(xì)管氣相色譜柱：美國Sigma 公司。

2 試驗方法

2.1 測定方法

2.1.1 鮮玉米麩皮的前處理

參照Hu YB 等的方法，略作改動[5]。

鮮玉米麩皮經(jīng)自來水沖洗至水澄清，在電熱鼓風(fēng)干燥箱中，90 ℃烘干。將烘干的鮮玉米麩皮粉碎，過20 目篩網(wǎng)，并在121 ℃條件下高壓滅菌20 min，于-20 ℃冰箱保存。

上述鮮玉米麩皮中加入0.05 mol/L，pH 值為6.5的磷酸緩沖液（1 ∶7，g/mL），室溫（25 ℃）條件下溶脹18 h，放置水浴鍋中，將溫度調(diào)節(jié)至75 ℃，加入淀粉酶（10 μL/g 鮮玉米麩皮），攪拌反應(yīng)1 h，將溫度調(diào)節(jié)至60 ℃，加入高轉(zhuǎn)化率糖化酶（4 μL/g 鮮玉米麩皮），攪拌下反應(yīng)30 min，加入堿性蛋白酶（100 μL/g 鮮玉米麩皮），攪拌下反應(yīng)4 h，100 ℃水浴中加熱10 min 滅酶，以去離子水邊沖洗邊抽濾，至去離子水澄清，將濾渣放入鼓風(fēng)干燥箱中，70 ℃條件下干燥12 h，即得去淀粉去蛋白質(zhì)鮮玉米麩皮（destarched and deproteinised fresh maize bran，DSDPB）。4 ℃冷藏備用。

2.1.2 木聚糖酶活力測定

木聚糖酶活力測定方法按照文獻(xiàn)方法并略作改動[5-6]。

以pH 4.5 醋酸-醋酸鈉緩沖液配制1.0%（質(zhì)量體積比）木聚糖底物溶液和稀釋酶液。分別在試管中加入木聚糖溶液和待測酶液共3.5 mL，于50 ℃反應(yīng)15 min，沸水浴中加熱10 min 滅酶，冷卻后，移取300 μL 于試管內(nèi)，加入900 μL 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosa licylicocid，DNS）試劑，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫（25 ℃）后在575 nm 條件下測吸光值。以每分鐘催化木聚糖生成1 μmol 還原糖所需的酶量為1 個酶活力單位（U）。每個試驗重復(fù)3 次。

2.1.3 纖維素酶活力的測定

纖維素酶活力的測定采用章紹兵[7]的方法，并略作改動。以鈉為底物，加入一定濃度30 μL 的Cellulase纖維素酶，混勻，40 ℃條件下反應(yīng)20 min，加入900 μL的DNS，沸水浴中加熱5 min，540 nm，測吸光度值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。纖維素酶活力單位定義為：在40 ℃、pH 5.0 條件下，每分鐘催化羧甲基纖維素鈉生成1 μmol 還原糖所需的酶量（U），還原糖以葡萄糖表示。每個試驗重復(fù)3 次。

2.1.4 阿拉伯木聚糖含量的測定

單糖組成測定按照文獻(xiàn)的方法，并略作改動[8-9]。以β 阿洛糖為內(nèi)標(biāo)，4 μL 經(jīng)還原、酯化及脫水處理的樣品注入氣相色譜儀中，經(jīng)Supelco SP-2380 色譜柱（長30 m，內(nèi)徑0.25 mm，膜厚度0.2 μm）分離；載氣：N2；檢測器：氫火焰離子化檢測器；進(jìn)樣溫度和檢測溫度為280 ℃。AXs 含量為阿拉伯糖與木糖含量之和乘以0.88。每個試驗重復(fù)3 次。

2.1.5 提取率的計算

提取率/%=100×提取物干重（g）/DSDPB 干重（g）

2.2 試驗設(shè)計

2.2.1 工藝路線

酶法提取鮮玉米麩皮阿拉伯木聚糖酶工藝路線如圖1 所示。

2.2.2 木聚糖酶與纖維素酶的復(fù)配

木聚糖酶與纖維素酶配合使用，可提高鮮玉米皮中AXs 的提取效率。本研究以提取率及提取物中AXs的含量為指標(biāo)，確定木聚糖酶和纖維素酶的復(fù)配比例。

圖1 酶法提取鮮玉米麩皮阿拉伯木聚糖工藝路線Fig.1 The extracting process route for arabinoxylan from fresh corn bran

木聚糖酶Amano HC 90 添加量的篩選：木聚糖酶添加量分別為50、100、400、550、700、850、1 000、1500、2 000 U/g 時，在pH4.8、溫度為50 ℃的條件下提取4 h。

木聚糖酶與纖維素酶的復(fù)配：在兩種酶的總添加量為1 500 U/g，木聚糖酶Amano HC 90 與纖維素酶的酶活比分別為200 ∶1、100 ∶1、50 ∶1、20 ∶1、10 ∶1、7.5 ∶1、5∶1 及1∶1 時，在pH4.8、溫度為50℃的條件下提取4h。

3 結(jié)果與討論

3.1 木聚糖酶的添加量對提取率和提取物中AXs 含量的影響

由于復(fù)合酶法提取鮮玉米麩皮AXs 中應(yīng)以木聚糖酶提取為主，因此，本研究先確定木聚糖酶的最適添加量，結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 可以看出，隨著木聚糖酶Amano HC 90 添加量的增加，提取率和提取物中AXs 含量明顯增加，當(dāng)Amano HC 90 添加量增加到850 U/g 時，提取物中AXs 含量不斷增加，此后不再增加，而提取率明顯增加，當(dāng)酶添加量為1 500 U/g 時，提取率最大，此后不再增加，因此，本研究確定酶的添加量為1 500 U/g 進(jìn)行復(fù)合酶的添加量的篩選。

圖2 木聚糖酶添加量對提取率及提取物中AXs 含量的影響Fig.2 The effect of Amano HC 90 dose on extraction yield and the AXs content in the extract

3.2 木聚糖酶與纖維素酶添加量之比對提取率和提取物中AXs 含量的影響

纖維素酶能夠消化細(xì)胞壁β－葡聚糖并且打破AXs 與β-葡聚糖之間非共價鍵，釋放更多AXs[10]。因此，使用纖維素酶與木聚糖酶復(fù)配，可大大提高AXs的提取率。本研究選取一種與木聚糖酶Amano HC 90作用條件較接近的食品工業(yè)用纖維素酶Cellulase 與之按不同比例復(fù)配，在加酶量為1 500 U/g 時，研究兩者比例對提取率和提取物中AXs 含量的影響，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 木聚糖酶與纖維素酶添加量之比對提取率及提取物中AXs含量的影響Fig.3 The effect of Amano HC 90 to Cellulase ratio on extraction yieldand the AXs contentin the extract

由圖3 可以看出隨著木聚糖酶與纖維素酶添加量之比的降低，提取率增大，而提取物中AXs 含量降低，綜合考慮，選取木聚糖酶與纖維素酶添加量之比為10 ∶1（酶活比）。

3.3 復(fù)合酶加酶量對提取率和提取物中AXs 含量的影響

鮮玉米麩皮在pH4.8，提取溫度為50 ℃，液料比為30 ∶1（mL/g），木聚糖酶與纖維素酶之比為10 ∶1（酶活比），加酶量分別為500、700、900、1 100、1 300、1 500、1 700 U/g 時，提取4 h，研究加酶量與提取率和提取物中AXs 含量之間的關(guān)系，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 加酶量對提取率和提取物中AXs 含量的影響Fig.4 The double-enzyme dose on the extraction yield and the AXs contentin the extract

由圖4 可以看出，提取率隨加酶量的增加持續(xù)增大，而提取物中AXs 含量在加酶低于900 U/g 時，隨加酶量的增加而提高，當(dāng)加酶量高于900 U/g 時顯著降低。這可能是由于當(dāng)加酶量高于900 U/g 時，纖維素酶用量增加，鮮玉米皮中的纖維素被部分提取出來，導(dǎo)致提取物中AXs 含量降低。因此，本研究選取加酶量900 U/g。

4 結(jié)論

本研究對復(fù)合酶法提取鮮玉米皮中AXs 中復(fù)合酶的比例和添加量進(jìn)行了研究。結(jié)果表明木聚糖酶與纖維素酶添加量之比為10 ∶1（酶活比），復(fù)合酶的添加量為900 U/g 時提取率和提取物中AXs 含量最高。經(jīng)本研究所采用的復(fù)合酶提取玉米皮AXs，提取率可達(dá)35 %以上，提取物中AXs 含量可達(dá)70%左右?？蓛?yōu)化此復(fù)合酶法提取工藝條件，進(jìn)一步提高提取率同時提高提取物中AXs 含量，使復(fù)合酶法生產(chǎn)玉米皮AXs 成為高效、環(huán)保的提取方法。