升降丸質量標準研究

陸 超 奚肇慶 吳 磊 田立元▲

1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院藥學部，江蘇南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院急診科，江蘇南京 210029

升降丸由生大黃、姜黃、炒僵蠶、蟬蛻組成，其方源于清代楊粟山所著《傷寒溫疫條辨》一書，具有宣泄三焦，行氣解散，調和氣血，升清降濁之功效[1-4]。用于惡寒發(fā)熱，寒戰(zhàn)高熱，煩躁不寧等癥狀。大量臨床研究顯示[5-10]，升降方可有效降低患者體溫，縮短發(fā)熱持續(xù)時間并有效防止體溫復升，有利于減少高熱并發(fā)癥的發(fā)生。方中炒僵蠶能勝風除濕、清熱解郁[11]；姜黃具有行氣散郁、辟疫除煩之功效[12-13]；大黃上下通行，清熱瀉火。大黃是方中一味主藥，其主要活性成分為蒽醌類化合物，包括結合型蒽醌和游離型蒽醌兩類，具有止血、抗菌、排毒等藥理作用[14-15]，與本方的功效相一致，本研究將蒽醌類成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為指標，以控制升降丸的質量。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

Waters-2695 高效液相色譜儀、Waters-2998 二極管陣列檢測器（美國，Waters 公司）；萬分之一天平（BP-211D 型，德國賽多利斯公司）；醫(yī)用超聲波清洗儀（KQ-1000E 型，昆山市超聲儀器有限公司）；HH-4 數顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.2 試劑與試藥

升降丸（江蘇省中醫(yī)院制劑部自制，批號：201708 001、201708002、201708003）；大黃對照藥材（鑒別用，批號：121249-201304）、姜黃對照藥材（鑒別用，批號：121188-201304）、大黃素對照品（含量測定用，批號：110756-201512）、大黃酸對照品（含量測定用，批號：110757-200106）、蘆薈大黃素對照品（含量測定用，批號：110795-201308）、大黃酚對照品（含量測定用，批號：110796-201319）、大黃素甲醚對照品（含量測定用，批號：110758-201405），以上均購自中國食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 姜黃 取升降丸2 g，研細，加無水乙醇50 mL，搖勻，放置30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇2 mL 使之溶解，作為供試品溶液；取不含姜黃的陰性粉末，同法制備陰性對照品溶液；另取姜黃對照藥材0.2 g，同法制成姜黃對照藥材溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開劑，展開，取出，晾干，置日光下檢視。在供試品溶液色譜中，與對照藥材溶液色譜相應位置上顯示相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 姜黃薄層色譜鑒別圖

2.1.2 大黃 取升降丸5 g，研細，加入甲醇50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水100 mL 使之溶解，加入鹽酸7 mL，加熱回流30 min，取出，放冷，濾液用乙醚振搖提取2 次，每次50 mL，合并乙醚液，揮干，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。另取不含大黃的陰性溶液，同法制備陰性對照品溶液；取大黃對照藥材粉末0.2 g，加甲醇20 mL，同法制成對照藥材溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于相同的以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上層溶液為展開劑展開，取出，晾干，置于氨蒸氣中熏后斑點變?yōu)榧t色。在供試品溶液色譜中，與對照藥材溶液色譜相應位置上顯示相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 大黃薄層色譜鑒別圖

2.2 含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，置于量瓶中，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含蘆薈大黃素108.9 μg、大黃酸115.0 μg、大黃素119.0 μg、大黃酚119.0 μg、大黃素甲醚56.8 μg 的混合標準品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將升降丸研細，取2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL 和鹽酸3 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，精密稱定，加甲醇補足減失的重量，濾過，精密量取濾液5 mL，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL 量瓶中，超聲處理20 min，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得[16]。

2.2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗 色譜條件Hedera C18ODS-2 色譜柱 （4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；以甲醇-0.1%磷酸水（80∶20）為流動相，檢測波長為254 nm，柱溫：25℃；流速：1.0 mL/min。

精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測定。供試品色譜與對照品色譜在相同的位置有較大吸收，陰性對照無干擾。理論板數按大黃素峰計算不低于3000。見圖3。

圖3 升降丸液相色譜圖

2.2.4 線性關系考察 取上述對照品溶液，用甲醇稀釋至含蘆薈大黃素108.90、72.60、48.40、32.27、21.51、14.34、9.56、6.37 μg/mL，含大黃酸115.00、76.67、51.11、34.07、22.72、15.14、10.10、6.73 μg/mL，含大黃素119.00、79.33、52.89、35.26、23.51、15.67、10.45、6.96 μg/mL，含大黃酚119.00、79.33、52.89、35.26、23.51、15.67、10.45、6.96 μg/mL，含 大 黃 素 甲 醚56.80、37.87、25.24、16.83、11.22、7.48、4.99、3.32 μg/mL 的對照品溶液。精密吸取各不同濃度的對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中測定。經線性回歸分析顯示，蘆薈大黃素在6.37～108.90 μg/mL范圍內，大黃酸在6.73～115.00 μg/mL 范圍內，大黃素在6.96～119.00 μg/mL 范圍內，大黃酚在6.96～119.00 μg/mL范圍內，大黃素甲醚在3.32～56.80 μg/mL 范圍內，分別與峰面積的積分值呈良好的線性關系。見表1。

表1 線性關系考察結果

2.2.5 精密度試驗 取同一個對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，重復測定6 次，以峰面積積分值計算，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚相對標準偏差（RSD）值分別為0.49%、0.36%、0.22%、0.46%、1.64%。結果顯示，儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取同一個批次（201708001）的升降丸2 g，研細，共6 份，精密稱定，按“2.2.2”項下處理方法制備供試品溶液。分別精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，測定，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含 量 計 算，RSD 值 分 別 為0.87%、0.76%、1.02%、1.21%、1.37%。結果顯示，該方法重復性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一個供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件，于0、2、4、6、8、12 h 分別進樣，測定色譜峰面積，分別以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量計算，RSD 值分別為0.67%、0.94%、0.88%、1.43%、1.13%。結果顯示，樣品在12 h 內穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密吸取已知含量的升降丸（201708001）1 g，共6 份，分別加入蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量。按“2.2.2”項下處理方法制備供試品溶液，進樣，測定，計算。結果蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回收率分別為89.91%、92.87%、91.24%、93.50%、88.64%，RSD 值分別為2.12%、1.06%、1.67%、2.31%、2.46%。結果顯示，該方法的準確性良好，符合含量測定的要求。見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.2.9 樣品含量測定 取3 個批次的升降丸樣品，每個批次2 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣，測定，計算。3 個批次樣品中大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/g）

3 討論

3.1 含量測定指標的選擇

大黃其性苦寒，是升降丸全方中的主藥。本實驗按照2015 版《中華人民共和國藥典》[17]中大黃含量測定項下要求，選擇蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚作為質控指標。

3.2 色譜條件的選擇

大黃蒽醌類成分的含量測定的流動相組成有：甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)、甲醇-0.2%磷酸系統(tǒng)、甲醇-0.4%磷酸系統(tǒng)、甲醇-乙腈-三乙胺系統(tǒng)以及乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)等[18-24]。預試驗[25]顯示甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）系統(tǒng)可以較好地分離5 種指標成分，重復性較好。