濕熱泄瀉模型大鼠的尿液代謝組學(xué)研究

彭曉婷，馬琪，張曉松，華永麗*，紀(jì)鵬，姚萬玲，魏彥明*

(1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730070； 2. 西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460)

濕熱泄瀉(dampness-heat diarrhea, DHD)是中(獸)醫(yī)泄瀉疾病常見證型之一，癥見腹痛泄瀉, 瀉下急迫；泄而不爽，糞黏膩惡臭；煩渴，尿色黃無力，舌苔黃膩，脈濡數(shù)或滑數(shù)[1-3]。DHD四季發(fā)病，病因復(fù)雜，多有外感濕熱毒邪、飲食不潔、外感疫癘、喜食肥甘厚膩等[4-5]。DHD纏綿難治易復(fù)發(fā)，每年可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，因此DHD發(fā)病機制的研究意義重大。

代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用廣泛，利用代謝組學(xué)技術(shù)可研究疾病發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)記物及監(jiān)測疾病等[6-7]。本研究采用高糖高脂+高溫高濕+產(chǎn)腸毒性大腸桿菌復(fù)制大鼠濕熱泄瀉模型，分析濕熱泄瀉潛在代謝標(biāo)志物與發(fā)病機制的關(guān)系，為研究濕熱泄瀉發(fā)病機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級Wistar大鼠20只，雌雄各半，5～6周齡，180～220 g，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK (甘) 2015-0006】，飼養(yǎng)條件：溫度(22±2)℃、濕度50%±5%、12 h光照12 h黑暗，代謝籠中適應(yīng)3 d。動物實驗程序與福利均符合實驗動物倫理學(xué)要求(倫理批準(zhǔn)編號：GSAU-AEW-2018-0618)。

1.1.2 菌種

產(chǎn)毒性大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(O101)，由中國微生物菌種保藏管理中心(北京)提供，菌號：CVCC231。

1.1.3 實驗試劑與儀器

色譜級甲醇(Tedia，17115181)；色譜級甲酸(Merck，H6070170)；色譜級乙腈(Merck，10900830)；56度紅星二鍋頭(北京紅星股份有限公司)；蜂蜜(上海冠生園蜂制品有限公司，GB14963)；市售豬油；戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich，P3761)；白細(xì)胞介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素2(IL-2)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒(北京奇松生物科技有限公司，QS20180329、QS20180413、QS20180426、QS20180411)。

質(zhì)譜儀(SYNAPT G2 XS QTOF，Waters，美國)；超高效液相色譜儀(2777C UPLC system，Waters，美國)；大鼠代謝籠；酶標(biāo)儀(iMark，BIO-RAD，美國)；全自動五分類動物血液細(xì)胞分析儀(BC-5300Vet，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實驗

按本實驗室前期建立的濕熱泄瀉模型復(fù)制方法建立濕熱泄瀉大鼠模型[8]。20只大鼠隨機分為對照組(control)與DHD模型組(model)，每組各10只。模型復(fù)制分三個階段，共18 d。第一階段：高糖高脂(HF)，10 d，雙日禁食，單日飼喂普通飼料，按體重4 mL/200 g灌胃豬油一次。第二階段：高溫高濕(HH)，5 d，每天按體重2 mL/200 g灌胃白酒一次，置于高溫高濕倉8 h,溫度(33±2)℃，濕度(93±2)%。第三階段：攻毒(EC)，3 d，產(chǎn)毒性大腸桿菌(1.06×109CFU/mL)按體重0.2 mL/200 g間隔24 h腹腔注射兩次，正常飼養(yǎng)1 d。實驗中，模型組大鼠自由飲用蜂蜜水(30%)，正常飼養(yǎng)對照組大鼠，灌胃、腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.2 樣本采集與制備

觀察記錄大鼠一般行為學(xué)變化，包括精神狀態(tài)、被毛、體溫、飲食、尿液與糞便等。

實驗結(jié)束用1%戊巴比妥鈉按體重40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈采血?；啬c與結(jié)腸各采1 cm，用4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī) HE 染色，顯微照相系統(tǒng)采集照片。

容器內(nèi)加0.5 mL防腐劑(2% NaN3)，收集第10天、第15天、第18天(各階段末天)對照組和模型組大鼠的尿液，-80℃保存。

尿液樣本的制備：各取100 μL尿液樣本混合制作QC樣本。從所有樣本(含QC)各取100 μL加入300 μL甲醇混勻，渦旋30 s，靜止1 min后4℃ 25 000 r/min離心10 min，取20 μL上清液與180 μL復(fù)溶液混勻，0.22 μm濾膜濾過備用。

1.2.3 指標(biāo)檢測

檢測血常規(guī)：WBC、RBC、PCV、MO、PLT、LY、HGB。

嚴(yán)格按說明書要求檢測細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、IL-2及TNF-α。

采用SPSS 21.0，組間數(shù)據(jù)差異顯著性采用單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05為差異有顯著性。

1.2.4 UPLC-Q/TOF-MS/MS分析條件

色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters，美國)；流動相：0.1%甲酸水溶液(A)0.1%甲酸乙腈溶液(B)；梯度洗脫條件：0～1 min：99%A；1～3 min：1%～15%B；3～6 min：15%～50% B；6～9 min：50%～95%B；9～10 min：95%B；10～12 min：99%A。柱溫：40℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件 正離子與負(fù)離子模式應(yīng)用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜SYNAPT G2-XS QTOF進(jìn)行樣本分析和數(shù)據(jù)采集。正離子模式采集條件：毛細(xì)管電壓0.25 kV，錐孔電壓40 V。負(fù)離子模式采集條件：毛細(xì)管電壓2 kV，錐孔電壓40 V。數(shù)據(jù)采集：MSE模式centroid，一級掃描范圍：50～1200 Da，掃描時間：0.2 s，20～40 eV能量碎裂母離子采集碎片信息，采集過程中每3 s對LE信號進(jìn)行實時質(zhì)量校正，使用QC樣品進(jìn)行控制。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用Progenesis QI軟件對原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、對齊、匹配和強度校正等處理，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst在線軟件進(jìn)行多元分析，單變量分析采用t檢驗和變異倍數(shù)分析(Fold change，F(xiàn)C)，多變量分析采用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)。差異代謝物篩選條件：FC ≥ 1.2 或FC ≤ 0.8，q< 0.05，VIP ≥ 1.0。

2 結(jié)果

2.1 大鼠臨床表現(xiàn)及模型評價

2.1.1 臨床表現(xiàn)

實驗中，對照組大鼠未表現(xiàn)明顯臨床癥狀。HF階段：DHD大鼠在禁食當(dāng)日飲水量增加，尿液淡黃量增加；灌服豬油當(dāng)日尿量減少，拉稀。HH階段：大鼠移入高溫倉后出現(xiàn)精神沉郁、食欲下降、被毛雜亂；移出高溫倉后精神明顯恢復(fù)，糞便濕潤成型，色偏黃，部分稀軟。EC階段：大鼠食欲下降、嗜睡、扎堆、體溫升高、眼瞼紅腫、眼部黃白分泌物增多，繼而腹瀉，大便稀薄色黃、黏膩發(fā)臭，肛門紅腫、肛周附著糞便，部分大鼠出現(xiàn)黏膿血便，見圖1。DHD大鼠臨床癥狀與中(獸)醫(yī)濕熱泄瀉臨床特征基本相符，通過血常規(guī)、炎性細(xì)胞因子以及組織病理切片做進(jìn)一步模型評價。

2.1.2 血常規(guī)

與對照組大鼠相比，模型組大鼠WBC、NE、MO、LY、RBC、HGB、PCV等指標(biāo)均升高，PLT降低(P<0.05)，見表1。

2.1.3 細(xì)胞因子

與對照組相比，模型組大鼠IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α水平均顯著升高(P<0.05)，見圖2，結(jié)合血常規(guī)檢測結(jié)果表明DHD模型大鼠體內(nèi)有嚴(yán)重炎癥反應(yīng)。

注：A：對照組；B：DHD模型組。圖1 大鼠臨床癥狀Note.A: Control group; B: DHD group.Figure 1 Clinical symptoms of the rats

表1 血常規(guī)檢測Table 1 Results of blood routine test

注：與對照組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group，*P< 0.05.

注：A.對照組回腸。a.模型組回腸。B.對照組結(jié)腸。b.模型組結(jié)腸。圖3 回腸與結(jié)腸組織的病理變化Note.A, Ileum of a control rat. a, Ileum of a dampness-heat diarrhea (DHD) rat. B, Colon of a control rat. b, Colon of a DHD rat.Figure 3 Histopathological changes of the rat ileum and colon tissues

圖2 促炎細(xì)胞因子含量Figure 2 Serum inflammatory cytokines levels of the rats

2.1.4 組織病理學(xué)

DHD模型大鼠回腸和結(jié)腸部分粘膜上皮細(xì)胞壞死脫落，偶見中性粒細(xì)胞浸潤。如圖3所示，對照組大鼠腸粘膜上皮完整性較好，模型大鼠回腸腸絨毛部分上皮脫落，隱窩有中性粒細(xì)胞浸潤，結(jié)腸上皮細(xì)胞部分壞死脫落，粘膜下層結(jié)締組織結(jié)構(gòu)消失，小腸腺周圍有中性淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2 代謝輪廓分析

如圖4所示，與對照組相比，模型組大鼠尿液樣本峰強和峰型在HF、HH和EC三個階段都有一定差異，提示DHD模型大鼠尿液中的代謝物在實驗中均發(fā)生紊亂。

2.3 模式識別分析

代謝數(shù)據(jù)PLS-DA分析見圖5，在正離子模式與負(fù)離子模式，對照組大鼠與模型組大鼠尿液樣本點在不同階段分離良好。DHD模型大鼠尿液代謝物變化趨勢在HF、HH和EC三個階段都有差異，表明模型大鼠體內(nèi)代謝水平因造模因素的影響而發(fā)生改變。

注：A.正離子模式。B.負(fù)離子模式。圖4 總離子流圖Note. A, ESI+ mode. B, ESI- mode.Figure 4 The total ions chromatograms (TIC) showing the urine changes of the rats

注：A: 正離子模式。B: 負(fù)離子模式。圖5 PLS-DA得分圖Note. A, ESI+ mode. B, ESI- mode.Figure 5 The PLS-DA scores

進(jìn)一步進(jìn)行OPLS-DA分析，見圖6。正離子模式R2Y是0.956、0.877、0.931，Q2是0.925、0.843、0.896，負(fù)離子模式R2Y是0.930、0.871、0.928，Q2是0.895、0.834、0.914。模型組大鼠尿液樣本點在不同階段均表現(xiàn)明顯分離聚類，說明DHD模型大鼠代謝譜發(fā)生改變。利用KEGG、METLIN、HMDB 等數(shù)據(jù)庫共篩選出102個差異代謝物。

注：A:對照組與高糖高脂組。B:對照組與高溫高濕組。C:對照組與攻毒組。a:正離子模式。b:負(fù)離子模式。圖6 OPLS-DA得分圖Note. A, Control and HF. B, Control and HH. C, Control and EC. a, ESI+ mode. b, ESI- mode.Figure 6 The OPLS-DA scores

2.4 差異代謝物鑒定

對代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本點間層次聚類分離，如圖7所示，與對照組相比，模型組大鼠不同階段尿液代謝狀態(tài)在正離子模式和負(fù)離子模式均明顯偏離。

注：A:對照組與高糖高脂組。B:對照組與高溫高濕組。C:對照組與攻毒組。a:正離子模式。b:負(fù)離子模式。圖7 差異代謝物熱圖Note. A, Control and HF. B, Control and HH. C, Control and EC. a, ESI+ mode. b, ESI- mode.Figure 7 The heatmap of differential metabolites

不同階段尿液差異代謝物Venn分析見圖8，正離子模式鑒定出差異代謝物57個，14個為兩個或三個階段共有；負(fù)離子模式鑒定出差異代謝物20個，5個為兩個或三個階段共有。如表2，有7種差異代謝物為三個階段共有可作為潛在代謝標(biāo)志物，分別是5-羥基-N-甲酰甲酰犬尿氨酸、左旋谷?；?左旋半胱氨酸、左旋甲酰犬尿氨酸、亞油酸、褪黑素、核黃素-5-磷酸和左旋色氨酸。

2.5 代謝通路分析

應(yīng)用MetaboloAnalyst構(gòu)建代謝通路，見圖9，DHD模型大鼠體內(nèi)亞油酸代謝、核黃素代謝和色氨酸代謝等代謝通路均發(fā)生改變，涉及脂類、能量和氨基酸代謝。

2.6 潛在代謝標(biāo)志物含量差異分析

將數(shù)據(jù)歸一化處理，以峰強度比較不同階段潛在代謝標(biāo)志物相對含量變化，如圖10，相較對照組，模型組大鼠尿液樣本中褪黑素、亞油酸、左旋甲酰犬尿氨酸和5-羥基-N-甲酰甲酰犬尿氨酸含量明顯降低(P< 0.05)，左旋色氨酸、核黃素-5-磷酸和左旋谷酰基-左旋半胱氨酸含量明顯升高(P< 0.05)。左旋色氨酸、核黃素-5-磷酸和左旋谷?；?左旋半胱氨酸的含量在實驗三個階段表現(xiàn)明顯的升高、降低和再升高變化；5-羥基-N-甲酰甲酰犬尿氨酸、褪黑素、亞油酸和左旋甲酰犬尿氨酸的含量呈現(xiàn)明顯的下降、升高和再下降變化。提示模型復(fù)制過程中，內(nèi)源性代謝物相對含量隨造模因素改變而改變。

3 討論

濕熱泄瀉病因復(fù)雜，有外感濕熱致內(nèi)生濕熱、飲食不潔、喜食肥甘厚膩或外感疫癘等，病位多在大腸，本實驗?zāi)Ｐ痛笫蠡啬c和結(jié)腸粘膜上皮完整性被破壞，表明濕熱泄瀉可造成腸道損傷，與中醫(yī)理論一致?，F(xiàn)代研究認(rèn)為“外濕+內(nèi)濕+生物致病因子”能理想的模擬濕熱泄瀉的復(fù)雜病因及病程[9]。尿液比其他體液易獲取，蛋白質(zhì)、脂質(zhì)含量較少，基本包含機體各種代謝物及代謝過程，是較為理想的代謝組學(xué)研究樣本[10]。本實驗各階段模擬不同致病因素，應(yīng)用尿液代謝組學(xué)技術(shù)，篩選出核黃素-5-磷酸、左旋甲酰犬尿氨酸、5-羥基-N-甲酰甲酰犬尿氨酸、左旋色氨酸、褪黑素、左旋谷?；?左旋半胱氨酸和亞油酸等7個潛在代謝標(biāo)志物，涉及核黃素代謝、色氨酸代謝、亞油酸代謝等代謝通路。

注：A:正離子模式。B:負(fù)離子模式。圖8 差異代謝物Venny圖Note. A, ESI+ mode. B, ESI- mode.Figure 8 The Venn diagram of differential metabolites

注：A:色氨酸代謝。B:亞油酸代謝。C:核黃素代謝。圖9 相關(guān)代謝通路Note. A, Tryptophan metabolism. B, Linoleic acid metabolism. C, Riboflavin metabolism.Figure 9 The relevant metabolic pathways

表2 DHD尿液潛在生物標(biāo)記物

圖10 潛在代謝標(biāo)志物含量變化Figure 10 Changes in the content of potential metabolic markers

3.1 核黃素代謝

核黃素-5-磷酸是體內(nèi)核黃素存在形式，其含量變化提示核黃素代謝改變。核黃素即VB2，是FMN和FAD兩種輔酶的主要活性基因，F(xiàn)MN和FAD參與機體蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸代謝[11]。核黃素代謝異常與多種疾病有關(guān)，如發(fā)熱、炎癥，研究發(fā)現(xiàn)核黃素-5-磷酸含量升高可能是機體發(fā)生強烈氧化代謝[12-14]。本研究DHD大鼠尿液核黃素-5-磷酸含量在HF、EC階段明顯上升，表明高糖高脂與攻毒使大鼠發(fā)生強氧化代謝。

3.2 色氨酸代謝

左旋甲酰犬尿氨酸、5-羥基-N-甲酰甲酰犬尿氨酸、左旋色氨酸和褪黑素的含量變化反映色氨酸代謝改變。色氨酸是血清素前體，其代謝主要發(fā)生在炎癥組織，研究表明抗原遞呈細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞因子通過釋放活化的免疫細(xì)胞，促進(jìn)吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)的活化及表達(dá)加速色氨酸降解[15-16]。色氨酸代謝與炎癥性腸病密切相關(guān)，其在胃腸道代謝有三種主要途徑[17]。(1)腸道微生物將色氨酸轉(zhuǎn)化為幾種分子，包括芳烴受體(AhR)的配體，AhR信號傳導(dǎo)被認(rèn)為是屏障部位免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分，通過作用于上皮細(xì)胞更新影響屏障完整性和免疫細(xì)胞增殖，對腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[18]。(2)IDO在免疫細(xì)胞和上皮細(xì)胞中的犬尿氨酸途徑(KP)，通過腸道中KP進(jìn)行色氨酸代謝由限速酶IDO1介導(dǎo)，產(chǎn)生犬尿氨酸(Kyn)和下游產(chǎn)物，犬尿氨酸代謝產(chǎn)物濃度隨胃腸道增加，通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR35表現(xiàn)粘膜保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用[19-20]。(3)色氨酸羥化酶1(TpH1)在腸嗜鉻細(xì)胞中的5-羥色胺(5-HT)途徑。5-HT是影響腸道信號傳導(dǎo)的重要信號分子，間接影響腸道蠕動、分泌、血管舒張和吸收[21]。DHD大鼠尿液色氨酸水平顯著降低，三種關(guān)鍵的色氨酸代謝物(Kyn，5-HT和5-HTP)的水平顯著增加，表明大鼠腸道蠕動、舒張和吸收均受到影響。

3.3 亞油酸代謝

亞油酸參與細(xì)胞生長、凋亡及免疫調(diào)控，有降膽固醇和降低心血管疾病與乳腺癌風(fēng)險的作用[22-23]。亞油酸可生成花生四烯酸，花生四烯酸是某些促炎類物質(zhì)前體，如PGE2、LTB4、TXA2，促炎類花生酸可促進(jìn)IL-6、TNF-α、CRP的生成[24-25]。本試驗IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α四種促炎細(xì)胞因子均升高，結(jié)合血常規(guī)檢測結(jié)果提示機體發(fā)生炎癥反應(yīng)。DHD大鼠尿液中亞油酸含量明顯降低，可能是由于機體炎癥反應(yīng)消耗能量降低亞油酸水平[26]。尿液中亞油酸濃度降低意味著能量供需不平衡，與所致炎癥不良結(jié)果相關(guān)。

DHD可能是動物受外界致病因素影響，體內(nèi)免疫細(xì)胞通過某些途徑誘導(dǎo)炎癥因子活化，造成體內(nèi)色氨酸代謝、核黃素代謝與亞油酸代謝等代謝通路發(fā)生改變，進(jìn)而使機體整個代謝系統(tǒng)發(fā)生紊亂，從而引起DHD的發(fā)病。