缺血性心肌病大鼠心肌細(xì)胞自噬在心肌重塑中的作用*

陳少青， 萬 全， 白婷婷， 王春貴， 宣麗穎， 王 羽△， 趙 明△

(1. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院， 通遼 028000； 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 通遼 028000)

缺血性心肌病是慢性冠脈疾病類型之一,主要表現(xiàn)為心室擴(kuò)大及心力衰竭[1]。其原因是由于長(zhǎng)期冠脈缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡及纖維組織增生等病理改變引發(fā)的心肌重塑。目前認(rèn)為，在細(xì)胞死亡類型中除了壞死和凋亡外，還存在一種Ⅱ型程序性死亡，即自噬。自噬在心臟疾病發(fā)展中具有雙重作用，在一些情況下，自噬可以降解損傷的細(xì)胞器，提供氨基酸及游離脂肪酸，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，但自噬過度激活卻對(duì)心肌產(chǎn)生損傷[2]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)由動(dòng)態(tài)變化的囊狀和管狀結(jié)構(gòu)組成的重要細(xì)胞器。新合成的膜蛋白與分泌蛋白的折疊與糖基化修飾、脂質(zhì)的合成以及Ca2+的貯存均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行。當(dāng)各種原因?qū)е聝?nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡時(shí)，出現(xiàn)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常聚集并引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性蛋白分泌增加，識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白，通過蛋白酶體將其降解，上述一系列反應(yīng)過程即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)[3]。目前關(guān)于缺血性心肌病心肌重塑與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬相關(guān)性報(bào)道較少，本研究通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立缺血性心肌病大鼠模型，觀察其大鼠心肌重塑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，探討缺血性心肌病心肌重塑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物藥品與儀器

GRP78抗體，LC3-I抗體、LC3-II抗體、Beclin-I抗體購自Boster公司，內(nèi)參β-actin購自wanleibio公司；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)購自成都泰盟軟件有限公司。36只體重180～220 g雄性SD大鼠。

1.2 缺血性心肌病大鼠模型的制備

選體重180～220 g清潔級(jí)雄性大鼠36只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、缺血性心肌病組，每組12組。正常對(duì)照組未進(jìn)行任何處理；假手術(shù)組及缺血性心肌病組大鼠用20%的氨基甲酸乙酯(5 mg/kg)腹腔注射麻醉后，切開頸部皮膚并分離氣管，做氣管插管與人工呼吸機(jī)相連，按肢體標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)нB接BL420生理儀記錄心電圖。呼吸頻率60 beats/min，呼吸比率為3∶1，通氣量1 ml/g。沿胸骨左緣第二，三肋間隙迅速打開胸腔及心包，暴露心臟，用0/3號(hào)縫合線從左心耳下緣1 mm 處進(jìn)針，于肺動(dòng)脈圓錐左緣出針，將心臟復(fù)位，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，關(guān)閉胸腔，觀察心電圖變化，以心電圖ST段抬高、T波高尖作為模型是否成功的標(biāo)志，缺血20 min后，迅速打開胸腔，解開結(jié)扎線行再灌注，關(guān)胸并記錄心電圖變化。假手術(shù)組大鼠在相同位置只穿線而不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。手術(shù)結(jié)束關(guān)閉及縫合胸腔，關(guān)閉呼吸機(jī)拔出氣管插管縫合氣管創(chuàng)口及頸部皮膚，從手術(shù)日開始每日觀察大鼠的一般狀態(tài)，包括飲食，毛色，活動(dòng)和排泄情況。

1.3 心臟彩超檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)開始第2周、第4周，各組大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥進(jìn)行麻醉，行心臟超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)變化及心臟功能。

1.4 病理取材及切片制作

第4周心臟彩超檢查后，立即處死大鼠，在無菌狀態(tài)下剪開大鼠左肋，去除心包后暴露心臟，取出心臟，將左心室肌組織放入4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，切片，將心肌切片脫蠟、二甲苯透明，行HE、masson染色，于光鏡下觀察病理變化。同時(shí)取左心室組織放入4%戊二醛溶液固定，準(zhǔn)備行電鏡觀測(cè)超微組織變化。

1.5 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌細(xì)胞GRP78、LC3-I、LC3-II、Beclin-I表達(dá)

采用RIPA裂解液提取各組大鼠心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)后，配置10%SDS-PAGE蛋白膠后，加樣并跑膠，跑膠程序設(shè)置為90 V 進(jìn)行15 min后，150 V進(jìn)行1 h，應(yīng)用半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)模， 5% BSA 37℃封閉1 h后，加入一抗GRP78(1∶1 000)，LC3-I(1∶ 1 000)，LC3-II(1∶1 000)，Beclin-1 (1∶1 000)，4℃孵育過夜后，次日PBST洗膜3次每次10 min后，二抗37℃孵育1 h，PBST洗膜3次每次10 min。ECL顯影檢測(cè)小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78與自噬相關(guān)蛋白LC3-I、LC3-II、Beclin-I表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠精神、飲食、活動(dòng)、毛色及死亡數(shù)量的變化

對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠毛發(fā)光亮，體質(zhì)量隨時(shí)間增加，缺血性心肌病組大鼠毛發(fā)灰暗，體質(zhì)量有所減輕，3組大鼠飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程中均未出現(xiàn)死亡。

2.2 各組大鼠心臟彩超變化

對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠手術(shù)后2周及4周心臟超聲檢查心臟結(jié)構(gòu)及功能未見明顯改變，與對(duì)照組及假手術(shù)組比較，缺血性心肌病組大鼠手術(shù)后2周及4周心臟超聲檢查心室擴(kuò)大，EF值降低(圖1，表1)。

Fig.1Heart color Doppler ultrasound images of each group

A: Control group; B: Sham-operated group; C: Ischemic cardiomyopathy group (2 week); D: Ischemic cardiomyopathy group (4 week)

GroupEF%Control85±3Sham-operated82±4Ischemic cardiomyopathy (2 week)71±6??##Ischemic cardiomyopathy (4 week)64±2??##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vssham-operated group

2.3 光鏡下心肌組織的變化

HE染色顯示：對(duì)照組與假手術(shù)組沒有明顯區(qū)別，與對(duì)照組大鼠比較，缺血性心肌病大鼠出現(xiàn)心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)水腫；masson染色顯示：對(duì)照組與假手術(shù)組沒有明顯區(qū)別，與對(duì)照組大鼠比較，缺血性心肌病大鼠心肌纖維明顯增生(圖2，見彩圖頁Ⅱ)。

2.4 心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變

對(duì)照組與假手術(shù)組沒有明顯區(qū)別，對(duì)照組大鼠心肌電鏡下肌節(jié)完整，線粒體清晰，心肌纖維排列整齊，缺血性心肌病大鼠線粒體空泡化嚴(yán)重，心肌纖維排列紊亂，肌節(jié)完整性受損(圖3)。

Fig.3Transmission electronic microscope images of rat cardiomyocyte

A: Control group; B: Ischemic cardiomyopathy group

2.4 Western blot檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞GRP78、LC3-I、LC3-II、Beclin-I表達(dá)變化

對(duì)照組與假手術(shù)組沒有明顯區(qū)別，與對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠比較，缺血性心肌病組大鼠心肌GRP78、Beclin-I、LC3-II /LC3-I比值表達(dá)明顯增加(P<0.01，圖4，表2)。

Tab. 2 The expressions of GRP78, LC3-I, LC3-II and Beclin-I in rats’ heart of each group n=12)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsSham-operated group

Fig.4The expressions of GRP78, LC3-I, LC3-II and Beclin-I in rats’ heart of each group

3 討論

當(dāng)今，我國(guó)生活水平逐步提高，冠心病的發(fā)病率及由冠心病所致心力衰竭的發(fā)病率越來越高，而缺血性心肌病是慢性冠脈疾病類型之一。目前缺血性心肌病已成為全球常見影響生命的主要疾病。

本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠缺血性心肌病模型，以心電圖ST段抬高、T波高尖作為模型是否成功的標(biāo)志，缺血20 min后，迅速打開胸腔，解開結(jié)扎線行再灌注，關(guān)胸并記錄心電圖變化。模型建立成功后，超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各大鼠心功能，發(fā)現(xiàn)心臟超聲檢查心室擴(kuò)大，EF值降低。病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺血性心肌病大鼠心肌損傷，心肌纖維化明顯，說明缺血性心肌病大鼠有明顯的心肌重塑現(xiàn)象。電鏡觀察缺血性心肌病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)線粒體空泡及肌纖維排列紊亂及斷裂，心肌缺血、缺氧后心肌細(xì)胞線粒體受損，影響心肌細(xì)胞氧化磷酸化， ATP產(chǎn)生減少，引發(fā)心肌細(xì)胞死亡及纖維組織增生。文獻(xiàn)報(bào)道ATP產(chǎn)生減少可能引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[4]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78KD(GRP78)是熱休克蛋白家族中的一類，是一種多功能鈣離子結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解[5]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子伴侶，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血性心肌病大鼠心肌中GRP78蛋白表達(dá)增高，說明缺血性心肌病與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)。自噬在心血管疾病中具有重要作用。目前大部分研究認(rèn)為自噬是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激條件下誤折疊蛋白促進(jìn)細(xì)胞存活的機(jī)制；通過促進(jìn)未折疊蛋白的清除、清除受損傷的線粒體或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，自噬可以恢復(fù)細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞存活[6-8]。大量臨床研究證實(shí)，自噬參與心力衰竭的發(fā)生發(fā)展過程[9]。研究顯示，Bcl-2相互作用蛋白(Beclin-1)過表達(dá)的小鼠心肌細(xì)胞中自噬活動(dòng)增加，心功能降低，LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，被認(rèn)為是自噬小體的標(biāo)志分子[10]。本實(shí)驗(yàn)觀察了自噬與缺血性心肌病的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Beclin-I、LC3-II /LC3-I比值表達(dá)明顯增加，證明自噬與缺血性心肌病有重要關(guān)系。

綜合文獻(xiàn)報(bào)道及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以推測(cè)缺血缺氧引發(fā)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞自噬增加，吞噬受損的線粒體及清除內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白，幫助細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。但在心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與自噬哪一個(gè)是啟動(dòng)因子以及具體觸發(fā)機(jī)制目前尚不清楚，有待于在以后的實(shí)驗(yàn)中明確。