白芷指紋圖譜研究進(jìn)展*

孫艷雪，關(guān)海濱，喬 穎，張紅梅，黃若暉，周志華，張 燁

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院(呼和浩特 010110)

白芷傘形科植物Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.或杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan的干燥根。主產(chǎn)地分布于中國西南，東北，華北等地域[1]。白芷具有鎮(zhèn)痛，抗炎，美白等功效[2-4]；此外小劑量的白芷對呼吸中樞，迷走神經(jīng)等也有一定的興奮作用[5]。白芷的化學(xué)成分含有香豆素類，揮發(fā)油和微量元素等[6]?！吨腥A人民共和國藥典》2015年版一部通過對是否含有歐前胡素和異歐前胡素兩種成分的熒光斑點(diǎn)及歐前胡素的含量來控制白芷的質(zhì)量。中藥白芷的化學(xué)成分復(fù)雜，僅通過這兩種成分的含量來控制其質(zhì)量，難以得到真正的控制。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)這兩種成分也會同時(shí)存在于川明參等藥材中，其專屬性也存在缺陷，易造成假冒偽劣問題。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。指紋圖譜[7]可綜合反映樣品化學(xué)成分種類，并根據(jù)對比其特征峰和共有峰面積進(jìn)行綜合評價(jià)其質(zhì)量情況。指紋圖譜具有特征性，系統(tǒng)性和整體性等特點(diǎn)?？筛鼮槿娴兀C合地對藥材進(jìn)行質(zhì)量控制及評價(jià)?，F(xiàn)已被國際社會所認(rèn)可。本文通過對白芷指紋圖譜的研究進(jìn)行總結(jié)，為白芷藥材的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1 化學(xué)指紋圖譜

1.1 色譜指紋圖譜

1.1.1高效液相圖譜:高效液相色譜(HPLC)具有高速，高效，高靈敏度，操作自動化，應(yīng)用范圍廣和柱子反復(fù)使用的特點(diǎn)。由于這些優(yōu)點(diǎn)現(xiàn)已成為指紋圖譜使用較多的方法之一，且已積累了較多經(jīng)驗(yàn)。根據(jù)其成分特點(diǎn)進(jìn)行色譜條件的選擇，再結(jié)合不同的檢測器，運(yùn)用相似度評價(jià)系統(tǒng)等進(jìn)行成分的數(shù)據(jù)分析。可實(shí)現(xiàn)白芷藥材產(chǎn)地，優(yōu)劣，真?zhèn)蔚膮^(qū)分。前人采用不同的色譜條件建立了HPLC指紋圖譜。色譜柱大都采用反相C18色譜柱，而且檢測波長多采用254 nm或320 nm，區(qū)別在于其他色譜條件的不同，導(dǎo)致其色譜峰存在一定差異。

不同產(chǎn)地的藥材因生長環(huán)境不同，其質(zhì)量可能存在一定的差異。章軍等[8]使用RP-HPLC指紋圖譜法區(qū)分不同品種的白芷藥材。以0.1%冰醋酸乙腈和0.1%冰醋酸水為流動相，梯度洗脫，得到樣品的色譜圖同時(shí)進(jìn)行相似度的計(jì)算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)確定了11個(gè)共有指紋峰且相似度都大于0.9。將其色譜峰進(jìn)行對照區(qū)分為白芷和杭白芷。吳耀華等[9]對來自不同產(chǎn)地的21批白芷樣品有效成分含量進(jìn)行測定，將其分為兩組，建立HPLC指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這21批樣品中共有21個(gè)共有特征峰。兩組樣品的相對保留時(shí)間和相對峰面積的RSD對比后無明顯差異，體現(xiàn)了指紋圖譜的一致性及穩(wěn)定性，為進(jìn)一步鑒定白芷藥材質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。王婷婷等[10]采用相同的流動相，不同的梯度條件，對21批次的不同產(chǎn)地的白芷進(jìn)行指紋圖譜聚類分析。檢測到21個(gè)共有峰，經(jīng)相似度系統(tǒng)分析后，相似度都小于0.9，證明藥材樣品質(zhì)量一般。張慧等[11]以甲醇和水為流動相，建立不同產(chǎn)地的12批白芷藥材水提液的指紋圖譜，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)13個(gè)共有峰且色譜峰分離狀況良好?？捎糜诎总扑幉牡馁|(zhì)量評價(jià)。

影響白芷質(zhì)量的因素有許多，全面地分析影響白芷質(zhì)量的因素，對提高其質(zhì)量尤為重要。譚秋生等[12]建立了HPLC指紋圖譜，分別從熏硫，采收日期，生長土壤，海拔高度，產(chǎn)地，表皮類型，加工方法這些方面，探究影響渝產(chǎn)白芷質(zhì)量的主要因素。結(jié)果表明產(chǎn)地，土壤及采收加工方法對其質(zhì)量影響最大。其相似度，除熏硫樣品外，都在0.9以上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)白芷經(jīng)熏硫加工處理后，其香豆素含量明顯減少，質(zhì)量變差，這種加工方法需改進(jìn)。

白芷的加工方式多種多樣，不同加工方式對其質(zhì)量產(chǎn)生不同影響。席梅等[13]以甲醇和水為流動相，梯度洗脫80 min,對來自于不同產(chǎn)地的10批的祁白芷，禹白芷，杭白芷，滇白芷樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，分別選取每個(gè)組別中的特征峰與其相對峰面積進(jìn)行對比，然后進(jìn)行相似度的系統(tǒng)檢測。結(jié)果顯示杭白芷，滇白芷部分批次為偽品，禹白芷為優(yōu)品，其余樣品質(zhì)量一般?？赡苁巧a(chǎn)環(huán)境和產(chǎn)地的不同所導(dǎo)致的結(jié)果。吳曉毅等[14]建立HPLC指紋法對市場上購買的來自12個(gè)藥房的白芷飲片與自然晾干和硫磺熏蒸藥材的指紋圖譜進(jìn)行對比，而后進(jìn)行質(zhì)量一致性的評價(jià)。對12份白芷飲片樣品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定有12個(gè)共有峰，并且發(fā)現(xiàn)硫磺熏蒸藥材與飲片指紋圖譜差異不大，得出這10批飲片均為硫磺熏蒸藥材。9批樣品的相似度都大于0.9,說明不同地域白芷飲片的質(zhì)量特征性相同。盧曉琳等[15]研究不同加工方法的11批白芷樣品提取物HPLC指紋圖譜，其中10批未熏硫藥材，1批熏硫白芷藥材，色譜條件以水和甲醇-四氫呋喃為流動相，梯度洗脫60 min,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10批未熏硫白芷樣品的提取物圖譜相似度均在0.9以上，并確定了9個(gè)特征峰且對其中8個(gè)特征峰進(jìn)行了指認(rèn)。對熏硫白芷樣品的提取物與對照圖譜進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)部分出現(xiàn)缺失現(xiàn)象，可能是藥品的處理方式對其質(zhì)量產(chǎn)生了一定的影響。譚秋生等[16]選取不同產(chǎn)地的白芷樣品研究加工方式對其質(zhì)量的影響，建立HPLC指紋圖譜。其除沙方式有水洗和刷除，而后對其進(jìn)行切片或切塊。結(jié)果顯示各組別的相似度都在0.9以上，其中水洗+切塊組的相似度最大。但水洗又造成歐前胡素含量損失，因此白芷不宜水洗和切片。白芷采后曬干工藝是傳統(tǒng)的商品處理方法。近幾十年來，一些中藥肉質(zhì)根或根莖的自然干燥過程已被硫磺熏蒸所取代，以縮短干燥時(shí)間和防治害蟲。盧曉琳等[17]對熏硫加工前后白芷圖譜進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)白芷經(jīng)硫熏后的色譜峰面積較未熏硫的普遍減小，可以作為是否熏硫的依據(jù)。而且白芷熏硫后易造成香豆素類成分含量降低，導(dǎo)致質(zhì)量變差。認(rèn)為硫磺熏蒸法是一種不可接受的中藥加工方法。因此人們一直希望可以找到可以代替硫熏保存藥材的方法。

1.1.2 超高效液相色譜和高分離度快速液相色譜:超高效液相色譜(UPLC)和高分離度快速液相色譜(RRLC)相關(guān)的白芷指紋圖譜也有相關(guān)的報(bào)道。這兩種色譜較HPLC技術(shù)而言有更高的柱效，不僅提高了分析效率和靈敏度，同時(shí)也可對其化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，使中藥的研究有了更有效簡便的方法。目前對于中藥白芷的研究主要集中于香豆素類和揮發(fā)油，對黃酮類知之甚少。張靜等[18]結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)和RRLC建立了27批白芷藥材的指紋圖譜，探究藥材在硫熏前后的質(zhì)量，最終確定了23個(gè)共有峰。根據(jù)相似度評價(jià)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，熏硫前樣本相似度都大于0.9，而進(jìn)行熏硫后其相似度則為0.7～0.9。系統(tǒng)聚類分析和主成分分析可鑒別出白芷是否為熏硫樣品；相似度評價(jià)可區(qū)分白芷產(chǎn)地和質(zhì)量的優(yōu)劣。

1.1.3 中成藥指紋圖譜:此外，含有白芷成分的一些中成藥的指紋圖譜也有相關(guān)的研究。江潔怡等[19]對一家藥廠十批次白芷配方顆粒進(jìn)行HPLC指紋圖譜探究，確立了19個(gè)共有峰為特征峰，并進(jìn)行了指認(rèn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)8批樣品相似度均大于0.9，而另外兩批只有0.6，這兩批樣品色譜峰的豐度與其他樣品也存在差異?？赡苁琴A存時(shí)間過長導(dǎo)致成分分解所致。

1.1.4 色譜聯(lián)用技術(shù):液相色譜聯(lián)用技術(shù)在白芷指紋圖譜領(lǐng)域也有較多涉及。張超云等[20]采用HPLC和GC聯(lián)用技術(shù)對11批次的白芷樣品進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPLC圖譜中各批次藥材圖譜差異小且相似度較高，但GC圖譜中表明各批次成分含量存在一定差異，可能是揮發(fā)性成分損失導(dǎo)致的結(jié)果。兩種色譜手段聯(lián)用，系統(tǒng)地控制了白芷的質(zhì)量，方法綜合可靠。梁璐[21]建立HPLC-TLC聯(lián)用法對10批白芷飲片的真?zhèn)?，?yōu)劣進(jìn)行探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLC有特征斑點(diǎn)且顯色清晰,HPLC確定了10個(gè)共有峰，其相似度均在0.8以上,質(zhì)量一般，但具有較好的相關(guān)性。兩者的聯(lián)用不僅可更加直觀辨認(rèn)其化學(xué)組成，對其質(zhì)量控制也有了良好的補(bǔ)充。此外，采用HPLC-DAD-ESI-MSn技術(shù)共鑒定或初步鑒定了20種呋喃香豆素，以及發(fā)現(xiàn)電噴霧離子阱質(zhì)譜儀中的破碎規(guī)律。

1.1.5 氣相色譜指紋圖譜:氣相色譜法是一種高效能，高選擇性，高靈敏度，操作簡單，應(yīng)用廣泛的分離分析方法。應(yīng)用于白芷的化學(xué)組成更加直觀易辨，是對HPLC的良好補(bǔ)充。王婷婷等[22]對白芷揮發(fā)油氣相色譜指紋圖譜進(jìn)行了分析，并對色素條件進(jìn)行考察。最終選定SE-30毛細(xì)血管色譜柱，程序升溫模式，對21批白芷藥材進(jìn)行聚類分析，分為四類，其中Ⅰ類，Ⅱ類為優(yōu)質(zhì)藥材。

1.2 紅外光譜指紋圖譜 紅外光譜有測定快，特征性強(qiáng)，無損檢測，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)。而且其分辨率高，由于中藥化學(xué)成分復(fù)雜，各成分含量不同，這一特點(diǎn)可進(jìn)行多個(gè)組分定性定量分析，可用于藥材的質(zhì)量評價(jià)。韓嘉欣等[23]采用傅里葉變換紅外光譜法結(jié)合共有峰率和變異峰率對不同品質(zhì)的來自三個(gè)產(chǎn)地的24批白芷親緣關(guān)系進(jìn)行探討。結(jié)果相似度均大于0.9，但川白芷和祁白芷較高，而毫白芷相似度較低。主成分分析和系統(tǒng)聚類分析可區(qū)分白芷產(chǎn)地。不同品質(zhì)的白芷共有峰度，變異峰度相差較大，說明不同產(chǎn)地白芷成分存在差異。毫白芷質(zhì)量最低，且與其他存在明顯差距，可能經(jīng)過熏硫處理所致。吳曉毅等[24]采用傳統(tǒng)方法-HPLC指紋圖譜-近紅外光譜技術(shù)，并結(jié)合OPUS/INDENT定性分析軟件對白芷進(jìn)行聚類分析。研究表明湖北，江西飲片較優(yōu)，質(zhì)量較好，同時(shí)證明傳統(tǒng)方式與現(xiàn)代分析方法分析結(jié)果相同。

2 分子生物學(xué)指紋圖譜

分子生物學(xué)指紋圖譜是在分子水平上運(yùn)用基因序列分析方法對中藥進(jìn)行分析研發(fā)。郭丁丁等[25]應(yīng)用ISSR標(biāo)記技術(shù)對白芷新鮮葉片進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果顯示ISSR指紋圖譜對白芷樣品遺傳變異分析奠定了基礎(chǔ)。陳要臻等[26]建立不同產(chǎn)地白芷新鮮葉片的AFLP反應(yīng)體系，選擇不同引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，最終篩選出7種引物，并構(gòu)建了AFLP指紋圖譜。這種技術(shù)為白芷鑒識和不同品種間多樣性提供了標(biāo)準(zhǔn)化程序。

3 譜效關(guān)系

白芷有活血化瘀方面的作用，張慧等[27]把指紋圖譜與這種活性結(jié)合后進(jìn)行探索，建立了白芷提取物的HPLC指紋圖譜，應(yīng)用多元回歸和灰色關(guān)聯(lián)度相結(jié)合的方法，最終得出4、9、11、12、16號峰為活血化瘀相關(guān)峰。該研究表明基于指紋效應(yīng)關(guān)系模型的定量策略可運(yùn)用于中藥的質(zhì)量監(jiān)測。

4 總 結(jié)

由于傳統(tǒng)方法的局限性，對于中藥材這種化學(xué)成分復(fù)雜的天然產(chǎn)物來說，有必要解決成分分離與鑒識這兩個(gè)問題，而采用單一分離模式也解決不了，也可能會導(dǎo)致大量信息的丟失。中藥指紋圖譜根據(jù)其整體性，綜合性，關(guān)聯(lián)性和層次性等特點(diǎn)可用于鑒別藥材真?zhèn)?，考察藥材?yōu)劣，區(qū)分藥材不同部位，檢測原料與成品之間的一致性和穩(wěn)定性。本文根據(jù)指紋圖譜技術(shù)的分類，綜述了白芷藥材及其中成藥的指紋圖譜的研究進(jìn)展，為白芷的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供參考依據(jù)。

近年來，色譜指紋圖譜被廣泛地應(yīng)用，且其發(fā)展速度較快。查閱大量文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)白芷的質(zhì)量控制多采用高效液相(HPLC)指紋圖譜。其他類型的指紋圖譜也在應(yīng)用，僅適用范圍不同。例如分子生物指紋圖譜多將色譜分離與分子生物學(xué)聯(lián)系起來，對白芷品種進(jìn)行鑒別研究，并建立其DNA指紋圖譜。隨著藥材商品的多樣化，中藥白芷假冒、偽、劣的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重。因此大量文獻(xiàn)都旨在控制白芷的質(zhì)量。高效液相(HPLC)指紋圖譜因其高速，高效，高靈敏度，應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，已經(jīng)成為白芷指紋圖譜的首選方法，且已經(jīng)積累的大量經(jīng)驗(yàn)。不僅可以單獨(dú)使用，也可以與二極管陣列檢測器(DAD)，質(zhì)譜(MS)，氣相色譜(GC)等聯(lián)合應(yīng)用，體現(xiàn)出不可逾越的優(yōu)越性，同時(shí)使白芷的質(zhì)量得到更好的檢測。

隨著對白芷指紋圖譜不斷深入地研究，指紋圖譜與藥效之間形成的譜-效關(guān)系日益得到關(guān)注。中藥指紋圖譜仍處于發(fā)展階段，需達(dá)到功能圖譜階段，即譜-效關(guān)系。將指紋圖譜與生物活性等相關(guān)的化學(xué)成分聯(lián)系起來建立相應(yīng)的綜合數(shù)據(jù)庫。當(dāng)前，白芷譜-效關(guān)系還處于初始階段，“譜”多集中于液相色譜指紋圖譜，完整的譜還不能標(biāo)示完整的“效”，無法實(shí)現(xiàn)其一致性。因此，深入研究白芷的譜-效關(guān)系，綜合運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，全面地控制白芷質(zhì)量，進(jìn)一步完善其鑒別和質(zhì)量控制系統(tǒng)尤為重要。