銀連祛風湯對慢性蕁麻疹動物模型的治療作用*

陶文靜，李曉霞，楊軍炎

1 南通漢藥中醫(yī)醫(yī)院，南通 226001；2 如皋市人民醫(yī)院，南通 226500；3 南通市第五人民醫(yī)院，南通 226361

蕁麻疹是一種常見的皮膚黏膜過敏性疾病，臨床表現(xiàn)為皮膚和黏膜突然出現(xiàn)大小不等、形狀不一的風團，境界清楚，皮疹此起彼伏，發(fā)無定處，劇烈瘙癢消退后不留痕跡，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白E（IgE）介導的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)、Th1 分泌的腫瘤壞死因子-γ（TNF-γ）等細胞因子含量降低和Th2 分泌的白細胞介素4（IL-4）等的含量升高、可能是導致慢性蕁麻疹發(fā)病的原因之一[1，2]。目前，治療慢性蕁麻疹西醫(yī)主要采用氯雷他定、依巴斯汀和鹽酸氟桂利嗪等藥物治療，但副作用大。中醫(yī)認為，慢性蕁麻疹病因多由風邪侵犯肌膚腠理導致營衛(wèi)失調(diào)；或因飲食不節(jié)，濕熱內(nèi)生，復感風邪。中醫(yī)治療由多藥組方協(xié)同增效、提高免疫力作用，從而降低發(fā)病率[3，4]。銀連祛風湯為名中醫(yī)經(jīng)驗方，臨床上用于治療慢性蕁麻疹，取得了良好的治療效果。為探討其作用機制，為臨床更廣泛應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)利用慢性蕁麻疹動物模型考察銀連祛風湯的治療效果及作用機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

銀連祛風湯（處方：銀花10 g，連翹10 g，生石膏30 g，生地30 g，白蒺藜20 g，土茯苓30 g，茵陳30 g，地膚子15 g，地骨皮15 g，炒僵蠶15 g，丹皮10 g，生甘皮5 g。共煎煮2 次，每次煎出液200 mL），該湯劑由南通漢藥中醫(yī)醫(yī)院煎藥室提供。人（體質(zhì)量60 kg）推薦攝入量為220 g生藥·d-1，相當于3.67 g生藥·kg-1·d-1。地氯雷他啶分散片（海南普利制藥股份有限公司），人（體質(zhì)量60 kg）推薦攝入量為5 mg·d-1，相當于0.083 mg·kg-1·d-1。

1.2 試劑

卵白蛋白[默克生命科學（上海）有限公司]；氫氧化鋁（AR 級，源葉生物科技有限公司）；小牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；IgE、TNF-γ、IL-4 試劑盒（上海藍基生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器

Elx-800 酶標儀（美國寶特）；TGL-16C 臺式離心機（上海醫(yī)療器械廠）；HH-w21-600 恒溫水浴箱（上海醫(yī)療恒溫設(shè)備廠）。

1.4 動物

昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄各半；白色豚鼠，體重（350±50）g，雌雄各半。均由南通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，小鼠合格證號：SYXK （蘇）2017－046、豚鼠合格證號：SYXK（蘇）2017－045。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。統(tǒng)計方法采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀連祛風湯對卵白蛋白＋氫氧化鋁誘導的慢性蕁麻疹模型小鼠瘙癢的影響

2.1.1 模型小鼠制備 取昆明種小鼠60 只，雌雄各30 只，雌性、雄性小鼠分別采用隨機數(shù)字表將小鼠分為6 組：空白組（生理鹽水）、模型組、銀連祛風湯低、中、高劑量組，陽性藥對照組（地氯雷他啶），且每組雌性、雄性小鼠各5 只。用氫氧化鋁加生理鹽水配制成氫氧化鋁懸液（1 g∶1 mL），除空白組不免疫外，其余各組小鼠腹腔注射卵白蛋白與氫氧化鋁懸液的混合液（0.1 mg＋0.1 mL）進行初次免疫，第10天再進行第二次免疫，共2 次[5]。

2.1.2 用藥方法 各用藥組小鼠在初次免疫后的第6 天開始灌胃給藥。陽性對照組的藥量為成人日均用量的10 倍，即0.83 mg·kg-1·d-1。取地氯雷他啶分散片10 片（50 mg），溶于1200 mL 水中備用。銀連祛風湯低劑量組的藥量為成人日均用量的5 倍，即18.35 g生藥·kg-1·d-1；銀連祛風湯中劑量組的藥量為成人日均用量的10 倍，即36.70 g生藥·kg-1·d-1；銀連祛風湯高劑量組的藥量為成人日均用量的15 倍，即55.05 g生藥·kg-1·d-1。將銀連祛風湯各劑量組生藥分別煎煮、濃縮、定容至1200 mL 備用。用藥組均灌胃對應(yīng)品種和對應(yīng)劑量的藥物，每天1 次，每天灌胃時間為上午8：00 整開始，灌胃順序依次為陽性藥組、銀連祛風湯低、中、高劑量組，模型組和空白組；均連續(xù)灌胃21 天，灌胃容量均為0.02 mL·g-1?？瞻捉M和模型組灌胃相應(yīng)容量的生理鹽水。

2.1.3 小鼠模型瘙癢情況 于第二次免疫后的30 min，將各組小鼠置放于安靜室內(nèi)，觀察小鼠行為狀態(tài)。數(shù)分鐘后，小鼠會出現(xiàn)前爪搔抓頭部，嘴咬軀干，后爪搔抓軀干，嘴咬尾巴等行為，該行為類似人類抓撓皮膚瘙癢狀。記錄30 min 內(nèi)各組小鼠搔抓次數(shù)和持續(xù)時間，上述任何一動作每發(fā)生一次計作一次搔抓。結(jié)果銀連祛風湯3 個劑量組均可不同程度地減少小鼠的搔抓次數(shù)，縮短搔抓的持續(xù)時間，并呈現(xiàn)良好的量效依賴關(guān)系，與空白組和模型組比較均有顯著性差異（P<0.01）。見表1。

2.2 銀連祛風湯對抗原所致豚鼠過敏性休克的影響

取豚鼠60 只，雌雄各30 只，利用隨機數(shù)字表分別將雌性、雄性豚鼠分為空白組（生理鹽水）、模型組、銀連祛風湯低、中、高劑量組，陽性對照組（地氯雷他啶），使每組雌性、雄性豚鼠各5 只。除空白組外，模型組和各給藥組豚鼠腹腔注射1∶20 小牛血清0.5 mL。7 天后，各組豚鼠灌胃給藥，方法和劑量同“2.1”項下一致，連續(xù)灌胃21 天。灌胃結(jié)束后的當日15：00，在每只豚鼠的心臟再注入1∶20 小牛血清2 mL。注射后，將各組豚鼠置放于安靜室內(nèi)，觀察豚鼠行為狀態(tài)。1 小時內(nèi)觀察到除空白組外各組所有豚鼠均出現(xiàn)煩躁不安、前爪搔抓鼻子、頻繁打噴嚏和咳嗽等癥狀，隨即出現(xiàn)痙攣、呼吸困難、大小便失禁等癥狀，最后站立不穩(wěn)、倒地，大部分豚鼠窒息死亡[6]。實驗結(jié)果表明，各用藥組均可延緩豚鼠的發(fā)敏時間，并呈現(xiàn)良好的量效依賴關(guān)系，與模型組比較差異有顯著性（P<0.01）。銀連祛風湯中、高劑量組效果更優(yōu)，可有效降低實驗豚鼠的死亡率。見表2。

表1 銀連祛風湯對實驗小鼠瘙癢的影響（±s，n=10）

表1 銀連祛風湯對實驗小鼠瘙癢的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

表2 銀連祛風湯對實驗豚鼠過敏性休克的影響（±s，n=10）

表2 銀連祛風湯對實驗豚鼠過敏性休克的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.01。

2.3 銀連祛風湯對模型小鼠IgE、TNF-γ、IL-4 表達水平的影響

對“2.1.2”項下灌胃給藥21 天后的各組小鼠摘除眼球取血2mL，室溫下3.0×103r·min-1離心15min，分離血清備用。脫頸處死小鼠后，分別取每只小鼠血管壁組織約0.5 g，加2 mL PBS 緩沖液（不含鈣鎂）勻漿，3.0×103r·min-1離心30 min，取上清液備用。利用ELISA 法[7]檢測血清及血管壁組織IgE、TNF-γ、IL-4 含量。檢測結(jié)果表明，銀連祛風湯3 個劑量組均不同程度地降低模型小鼠血清及血管壁組織IgE、IL-4 的含量，升高TNF-γ 的含量，并呈良好的量效依賴關(guān)系；與空白組、模型組比較均有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，血管壁組織中的各指標值改變更為明顯，其中高劑量組以上各指標值基本接近正常對照組（P>0.05）。見表3、表4。

表3 銀連祛風湯對實驗小鼠血清中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

表3 銀連祛風湯對實驗小鼠血清中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

表4 銀連祛風湯對實驗小鼠血管壁組織中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

表4 銀連祛風湯對實驗小鼠血管壁組織中IgE、TNF-γ、IL-4 表達的影響（±s，n=10）

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與地氯雷他啶組比較，★P<0.05，★★P<0.01。

3 討論

慢性蕁麻疹是皮膚超敏反應(yīng)性疾病，嚴重時可出現(xiàn)全身性超敏反應(yīng)，甚至過敏性休克[8]。此類反應(yīng)又以Ⅰ型超敏反應(yīng)為主[9]。

瘙癢是慢性蕁麻疹的主要臨床癥狀之一[10]。采用卵白蛋白＋氫氧化鋁制備了慢性蕁麻疹小鼠模型，考察銀連祛風湯緩解瘙癢癥狀的治療效果。研究表明，銀連祛風湯各劑量組均可明顯減少小鼠搔癢的次數(shù)和搔癢的持續(xù)時間，且呈現(xiàn)良好量效依賴關(guān)系。表明銀連祛風湯具有良好的止癢效果。

由于慢性蕁麻疹可發(fā)生全身性超敏反應(yīng)，利用豚鼠過敏性休克模型，考察銀連祛風湯的治療效果，結(jié)果表明該湯劑各劑量組均可延緩實驗豚鼠的發(fā)敏時間，與空白對照組及模型組比較均具有顯著性差異，且呈現(xiàn)良好量效依賴關(guān)系。其中銀連祛風湯中、高劑量可降低實驗豚鼠死亡率。顯示銀連祛風湯具有良好的抗過敏作用。

既往研究認為[11，12]，慢性蕁麻疹的發(fā)生與IgE 表達水平過高有關(guān)。IgE 能夠介導Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，通過免疫應(yīng)答并釋放大量組胺等介質(zhì)，從而引起蕁麻疹的一系列癥狀。慢性蕁麻疹患者細胞免疫功能失衡也是皮膚臨床關(guān)注的熱點[13]。研究發(fā)現(xiàn)[14]，Th1/Th2處于明顯失衡狀態(tài)是該病發(fā)病的原因之一，患者機體內(nèi)Th1 分泌的TNF-γ、IL-2 等細胞因子明顯減少，Th2 分泌的IL-4、IL-18 等細胞因子明顯增加，被認為是慢性蕁麻疹發(fā)病的基礎(chǔ)[15]。推測可能是Th1 型細胞因子表達水平降低，減弱了對IgE 的抑制作用，增強Th2 型細胞因子的表達，致使IgE 合成增多，促使蕁麻疹發(fā)生。因此尋找有效藥物糾正失衡的Th1/Th2 細胞因子水平是臨床治療的關(guān)鍵點[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹動物模型后，瘙癢癥狀明顯改善，血管壁組織及血清中TNFγ 含量明顯升高，IgE、IL-4 含量顯著降低，與文獻報道具有相似性[17]。此表明銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹可能與其糾正Th1/Th2 細胞因子水平相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，血管壁組織中的各指標值改善程度要優(yōu)于血清的改善程度，高劑量組中以上各指標值基本接近正常對照組。推測是慢性蕁麻疹發(fā)病時由于血管通透性上升，表皮更易出現(xiàn)紅斑、水腫等病變。經(jīng)銀連祛風湯治療后，血管通透性隨之降低，聚集在血管壁組織中IgE、IL-4 的水平明顯下降甚至消除，TNF-γ 水平代償性升高，并彌補其功能上的不足。而外周血由于全身循環(huán)的緣故，異常細胞因子的徹底改善會相對緩慢，出現(xiàn)了時間窗，類似人類慢性蕁麻疹皮損已消除，但如不鞏固治療會出現(xiàn)反復發(fā)作現(xiàn)象。

祖國醫(yī)學稱蕁麻疹為“癮疹”，風邪侵襲是主要病因，兼有寒邪或熱邪，氣血不足，濕熱內(nèi)蘊，病程拖沓，皮膚瘙癢為疾病主癥。銀連祛風湯處方中銀花、土茯苓清熱除濕，生地、丹皮涼血養(yǎng)陰，同為君藥，四藥合用共奏清熱、涼血、消風之功效；連翹、石膏清熱瀉火，為臣藥；白蒺藜與地膚子合用增強熄風止癢之功；茵陳清熱利濕；炒僵蠶息風止痙，祛風止痛；地骨皮清肺降火；生甘皮理氣降逆。全方合理配伍，共奏祛風清熱、涼血消風、潤燥通里之功。綜上所述，慢性蕁麻疹的病因?qū)W說和銀連祛風湯的組方原理異曲同工，并被本研究佐證。

4 結(jié)論

本研究探討了銀連祛風湯對慢性蕁麻疹動物模型的治療作用與相關(guān)機制，發(fā)現(xiàn)該湯劑能減少小鼠搔抓次數(shù)和搔抓的持續(xù)時間，明顯延緩實驗豚鼠的發(fā)敏時間，顯示其具有良好地止癢和抗過敏作用。研究還發(fā)現(xiàn)，銀連祛風湯能使模型小鼠血管壁組織及血清TNF-γ 含量明顯升高，IgE、IL-4 含量顯著降低，而且血管壁組織中的以上各項指標值的改善程度要優(yōu)于血清的改善程度。表明對血管壁組織及血清細胞因子的調(diào)節(jié)作用可能是銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹的作用機制之一。因此本實驗結(jié)果為銀連祛風湯治療慢性蕁麻疹提供了重要的實驗依據(jù)。