甘麥大棗湯對焦慮型腸易激綜合征大鼠行為學(xué)和腸組織中5-HT、SP、CGRP、TNF-α 的影響研究*

朱 靜，孫 峰，朱 華**，甘 瑜，陳 旭，3

1 江蘇省蘇北人民醫(yī)院，揚(yáng)州 225001；2 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225001；3 大連醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，大連 116044

腸易激綜合征 （irritable bowel syndrome，IBS）是臨床上常見的胃腸道功能性疾病，屬于世界級難治性疾病之一，患者以反復(fù)發(fā)作的腹痛、腹瀉為主要臨床表現(xiàn)[1]。IBS 病理機(jī)制復(fù)雜，其常與多種腸道神經(jīng)信號傳導(dǎo)因子神經(jīng)肽以及炎癥因子相關(guān)，如5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）、P 物質(zhì)（substance-P，SP）、降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP） 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[2]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，焦慮抑郁均是其常見的誘發(fā)因素和伴隨癥狀，單純胃腸動力調(diào)節(jié)藥物對IBS 的療效有限[3]，目前中藥組方治療IBS 的研究報(bào)道以調(diào)和肝脾、補(bǔ)脾柔肝的抗抑郁較為多見[4-7]，而對焦慮型IBS 及其對癥治療的藥物研究較少。

甘麥大棗湯為經(jīng)典的中藥安神劑，具有和中緩急、養(yǎng)心安神的功效，主治心陰不足、肝氣失和的臟躁證，即更年期綜合征、神經(jīng)衰弱、焦慮等。IBS 的焦慮癥狀也是甘麥大棗湯的適應(yīng)癥之一，臨床已有類似應(yīng)用和研究[8-10]。

本研究通過觀察甘麥大棗湯對IBS 模型大鼠的腸組織病理形態(tài)和體內(nèi)5-HT、SP、CGRP、TNF-α的影響，初步探討甘麥大棗湯治療焦慮型IBS 的作用機(jī)制。

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級健康雄性SD 大鼠70 只，重量為（210±20）g，購自揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK（蘇）：2017-0044。飼養(yǎng)條件：室溫（25±2）℃，相對濕度為50%±10%，每日交替12 h 光照，自由飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

甘麥大棗湯提取物為本實(shí)驗(yàn)室自制：炙甘草飲片 （Glycyrrhizae uralensis Fisch.）、小麥飲片（Triticum aestivum L.）、大棗 （Zizyphus jujube Mill.）均購自康美藥業(yè)股份有限公司，按9∶15∶26 比例設(shè)方，共計(jì)1000 g，10 倍水煎煮3 h，煎煮兩次，合并兩次藥液，減壓濃縮至1 g·mL-1備用。番瀉葉（Cassia angustifolia Vah.） 購自康美藥業(yè)股份有限公司。取番瀉葉500 g，10 倍水煎煮3 h，煎煮兩次，合并兩次藥液，減壓濃縮至1 g藥材·mL-1備用；鹽酸洛哌丁胺（西安楊森制藥有限公司），用生理鹽水配制成0.05 mg·mL-1混懸液備用。

大鼠5-HT 酶聯(lián)免疫試劑盒 （貨號：JM-01839R1）、大鼠SP 酶聯(lián)免疫試劑盒 （貨號：JM-01851R1）、大鼠CGRP 酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號：JM-02058R1）、大鼠TNF-α 酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號：JM-01587R1），均購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 儀器

CPA225D 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Infinite M200 Pro 型酶標(biāo)儀(上海帝肯貿(mào)易有限公司)；電子分析天平 （德國Sartorius 公司）；高速低溫冷凍離心機(jī)（湘儀TGL-20M）。

2 方 法

2.1 建立IBS 模型

從70 只SD 雄性大鼠隨機(jī)取10 只作為空白對照。剩余60 只建立焦慮恐懼模型，給予大鼠條件性刺激程序：噪音刺激3 h·d-1；足底電擊：間歇30 s 電擊2 s，1 h·d-1；夾尾刺激：束縛3 h·d-1和番瀉葉提取物1 g·mL-1灌胃2 mL，持續(xù)15 d。以腹瀉和高架十字法為標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)模型，觀察實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀。以模型大鼠進(jìn)入開放臂時間 （open arm time，OT）和進(jìn)入開放臂次數(shù)（open arm entry，OE）在總時間和總次數(shù)統(tǒng)計(jì)中OT%<20%和OE%<25%，則認(rèn)為焦慮模型成功（42 只被判定為成功），剔除高架十字篩選造模不合格的大鼠。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組

設(shè)正常的SD 雄性大鼠為空白組A；焦慮模型大鼠隨機(jī)分為5 組，每組8 只：IBS 模型組B、陽性藥組（鹽酸洛哌丁胺0.5 mg·kg-1）C、甘麥大棗湯低劑量組（每天一次，10 mL·kg-1）D、中劑量組（每天2 次，10 mL·kg-1）E、高劑量組（每天3 次，10 mL·kg-1）F。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法和樣本的取材方法

2.3.1 行為學(xué)評價(jià)實(shí)驗(yàn) 繼續(xù)維持對模型的刺激，同時按計(jì)劃給藥，持續(xù)15 d。最后一次給藥前6 h 對各組大鼠進(jìn)行高架十字法的焦慮評價(jià)，統(tǒng)計(jì)給藥前后OT%和OE%。

2.3.2 腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)與血清處理 末次給藥1 h 后給各組動物灌胃10%活性碳與5%阿拉伯膠混懸液（劑量10 mL·kg-1），30 min 后將實(shí)驗(yàn)大鼠行異氟烷麻醉、腹主動脈取血5 mL 于干燥管內(nèi)，4 ℃靜置1 h、4 ℃低溫3000×g 離心20 min，分離出血清；編號后迅速完成5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平的ELISA檢測。

將大鼠脫頸處死，剝離胃腸道，放置于平板上，測定幽門至碳墨前沿的距離，以及幽門至回盲部全長，使用公式計(jì)算腸推進(jìn)百分率。

腸推進(jìn)百分率（%）=炭墨前端與幽門的距離/小腸全長×100%

2.3.3 制備腸組織勻漿液和組織病理切片 分離大鼠結(jié)腸組織，PBS 沖淋洗掉黏連血塊，稱重約0.2 g，加1.8 mL PBS 緩沖液將腸組織勻漿，制得約10%組織勻漿液，4 ℃低溫、5000×g 離心10 min；取上清液編號后4 ℃冷藏備用，并取大鼠結(jié)腸組織PBS 沖淋洗掉碳墨及其他污染物，多聚焦浸泡脫水，做HE染色病理切片，觀察各組病理學(xué)變化。

2.3.4 ELISA 法檢測血清和腸組織中的5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平 采用酶聯(lián)法 （ELISA），按照ELISA 試劑盒說明書所提供的標(biāo)準(zhǔn)程序，對各實(shí)驗(yàn)組所采集的血清樣本和腸組織樣本的PBS 溶液進(jìn)行5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平測定，酶標(biāo)儀測定吸光度，并計(jì)算出含量結(jié)果。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 甘麥大棗湯對IBS 模型大鼠焦慮行為的影響

與模型組相比，甘麥大棗湯能顯著降低IBS 大鼠焦慮樣行為，中、高劑量組作用顯著，陽性藥組作用不顯著，見表1。

表1 甘麥大棗湯對IBS 大鼠焦慮樣行為的影響（±s）

表1 甘麥大棗湯對IBS 大鼠焦慮樣行為的影響（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05，給藥前后比較，△P＜0.05。

3.2 腸推進(jìn)率測量

與空白組對比，模型組腸推進(jìn)率顯著增加，陽性藥組對IBS 模型的腸道作用顯著，甘麥大棗湯可抑制IBS 的腸推動作用，但作用較陽性組弱。見表2。

表2 甘麥大棗湯對IBS 大鼠腸推進(jìn)的影響（±s）

表2 甘麥大棗湯對IBS 大鼠腸推進(jìn)的影響（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.3 HE 病理結(jié)果

與空白組對比，模型組和陽性對照組大鼠結(jié)腸組織中出現(xiàn)腸組織水腫的病變反應(yīng)，從甘麥大棗湯低劑量組中可見部分水腫反應(yīng)，高劑量組和中劑量組病理組織中水腫病變明顯減少。見圖1。

3.4 腸組織中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平

與空白組對比，IBS 模型組腸組織中SP、CGRP和TNF-α 水平均明顯提高；各給藥組與模型組相比均可不同程度降低大鼠腸組織中SP 和CGRP 含量，但甘麥大棗湯對血清中5-HT 和TNF-α 作用不顯著，與IBS 模型組無顯著差異，見表3。

表3 甘麥大棗湯對大鼠結(jié)腸組織中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

表3 甘麥大棗湯對大鼠結(jié)腸組織中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3.5 血清5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平

與空白組相比，IBS 模型組血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 水平均明顯提高；甘麥大棗湯3 組與模型組相比，均可不同程度降低大鼠腸組織中5-HT、SP 和CGRP 含量，但對TNF-α 作用不顯著，與IBS 模型組無顯著差異，見表4。

表4 甘麥大棗湯對大鼠血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

表4 甘麥大棗湯對大鼠血清中5-HT、SP、CGRP 和TNF-α 的影響（±s）

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

4 討論

腸易激綜合征不僅是一種慢性腸道功能紊亂性疾病，也是一種心身疾病，又稱為腸神經(jīng)官能癥。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，我國IBS 發(fā)病率為5%～12%[11]，IBS 發(fā)病原因復(fù)雜，涉及胃腸道動力調(diào)節(jié)障礙、內(nèi)臟感覺過敏、腸道炎癥和免疫反應(yīng)、精神心理因素、遺傳等。臨床中有42%～61%的患者存在心理障礙，常表現(xiàn)為廣泛性焦慮、情緒低落、驚恐，同時表現(xiàn)出一定的軀體障礙[12]。焦慮與抑郁是最常見的精神心理障礙癥狀，發(fā)病機(jī)制涉及多個神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)，如5-HT、SP、CGRP 等[13]，以及下丘腦-垂體-腎上腺軸功能等。研究證實(shí)，精神心理因素是IBS 發(fā)病和治療的關(guān)鍵[14]。

腸易激綜合征是腸神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)臟敏感和腸道動力調(diào)節(jié)紊亂等多因素所致的疾病，隨著對IBS病理機(jī)制的深入研究發(fā)現(xiàn)，腸道平滑肌運(yùn)動相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)因子以及一些炎癥因子與IBS 的發(fā)生有關(guān)聯(lián)性。5-HT 又叫血清素，是一種參與內(nèi)臟感覺和動力調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)，主要分布于腸黏膜嗜鉻細(xì)胞，血小板和腦組織也有少量分布，可以調(diào)節(jié)平滑肌張力，是腸道肌肉收縮力的重要來源，可以促進(jìn)胃腸壁收縮，在IBS 患者的血清中5-HT 水平顯著高于健康人群，同時，腸道中5-HT 的表達(dá)升高也伴隨著嗜鉻細(xì)胞的活躍程度增強(qiáng)，進(jìn)而發(fā)生嗜鉻細(xì)胞反饋合成并分泌大量5-HT，促進(jìn)腸道蠕動，提高內(nèi)臟敏感性，是IBS 發(fā)生泄瀉的重要病理因素[15]。SP 對腸道具有增強(qiáng)胃腸蠕動、增加消化道平滑肌收縮，并具有刺激腸黏膜血管舒張，增加腸道分泌水和電解質(zhì)的作用[16]。SP 的異常升高可使腸道平滑肌強(qiáng)烈收縮、增強(qiáng)結(jié)腸集團(tuán)運(yùn)動的作用，這與IBS 患者的腹痛和腹瀉的癥狀密切相關(guān)。CGRP 的主要生理作用是促進(jìn)胃腸道血流、分泌及運(yùn)動功能，也可以介導(dǎo)痛覺的傳遞[6]。通過改變局部血流、調(diào)節(jié)平滑肌的收縮及肥大細(xì)胞脫顆粒，CGRP 可使內(nèi)臟感覺的傳入信號發(fā)生改變，可能與腸易激綜合征患者的胃腸動力異常和腹痛有關(guān)[7]。IBS 患者長期腹痛和腹瀉常伴有腸道的炎癥反應(yīng)，TNF-α 能阻止內(nèi)毒素休克、有抗感染效應(yīng)，是IBS 患者重要的炎癥介質(zhì)指標(biāo)[17]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肝脾不調(diào)、脾失健運(yùn)以及肝郁氣滯是IBS 的主要病機(jī)，如《素問·藏器法時論篇》曰:“脾病者……虛則腹?jié)M腸鳴，飱泄不化?！边€可因?yàn)轱嬍巢还?jié)、外感時邪、情志失調(diào)、素體陰虛或陽虛，這些因素致使臟腑氣血失調(diào)，出現(xiàn)氣滯、血瘀，寒、濕、熱等內(nèi)生的一系列病理過程。辨證該?。浩浔憩F(xiàn)雖以脾胃為主，但病因多在肝失疏泄、肝木乘脾，致脾失健運(yùn)而起。肝病多涉及人身情志，情志受到肝的疏泄功能的調(diào)節(jié)，情志不遂，肝失疏泄、肝郁氣滯，則導(dǎo)致脾胃和腸氣機(jī)郁滯升降失常，出現(xiàn)類似IBS 的腹痛、腹瀉、便秘等癥狀。臨床治療除運(yùn)脾化濕、調(diào)和氣血外，還宜配合使用疏肝解郁、養(yǎng)心安神的方法來治療腸易激綜合征患者的抑郁、焦慮癥狀，對整體病癥也有顯著的療效。甘麥大棗湯來自《金匱要略》，由甘草、小麥和大棗組方，具有補(bǔ)益心脾、寧心安神之功效，主要治療因憂思過度、心神失養(yǎng)所致的的臟躁證，被廣泛用于抑郁癥、焦慮癥的治療，具有一定的療效[18]和良好的開發(fā)潛力[8，9]。

本研究采用慢性應(yīng)激誘發(fā)大鼠出現(xiàn)焦慮癥的同時，刺激腸道平滑肌出現(xiàn)腹瀉達(dá)到與IBS 相同的綜合癥狀。經(jīng)過15 天的模型刺激，以高架十字法篩選同時符合焦慮和腸易激特征的大鼠，然后再分組比較甘麥大棗湯對模型大鼠的干預(yù)作用。通過高架十字法的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甘麥大棗湯可以顯著改善IBS 大鼠的焦慮樣行為，對IBS 大鼠的腸推動亢進(jìn)也有一定的抑制作用。陽性對照藥雖然對腹瀉和腸推動的作用顯著，但不能改善IBS 模型的焦慮表現(xiàn)。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，甘麥大棗湯對IBS 模型大鼠腸組織和血清中異常升高的5-HT、SP、CGRP 均有明顯降低作用，而對TNF-α 作用效果不顯著。說明腸道炎性反應(yīng)可能不是甘麥大棗湯的作用位點(diǎn)，而甘麥大棗湯在調(diào)節(jié)其他重要的腸道神經(jīng)遞質(zhì)和中樞系統(tǒng)及抗焦慮抑郁狀態(tài)密切，對相關(guān)細(xì)胞因子水平的作用較顯著，可能是其治療IBS 的重要機(jī)制之一。

5 小 結(jié)

綜上所述，甘麥大棗湯對焦慮型IBS 大鼠的行為學(xué)和腸生理功能均有積極作用，可顯著改善IBS大鼠的焦慮樣行為，抑制腸道蠕動的亢進(jìn)，并且降低腸組織中5-HT、SP、CGRP 水平，而對腸道炎性因子作用較弱。