SD大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗背景數據的建立

賈玉玲，姜 娟，楊 陽，崇立明，周 莉，孫祖越

（1.上海市計劃生育科學研究所藥理毒理學研究室，中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心，上海200032；2.國家衛(wèi)生健康委員會計劃生育藥具重點實驗室，上海200032；3.復旦大學生殖與發(fā)育研究院，上海200032）

在藥物非臨床安全性評價研究中，生殖毒性研究是新藥評價重要的一個環(huán)節(jié)，其中胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗（即Ⅱ段）是妊娠動物自胚胎著床至硬腭閉合給藥，評價藥物對妊娠動物、胚胎及胎仔發(fā)育的影響。根據人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會（International Council for Harmonization，ICH）（S5）［1］和國家食品藥品監(jiān)督管理總局（China Food and Drug Administration，CFDA）［2］的指導原則，該研究推薦的嚙齒類動物為大鼠，但由于大鼠品系、個體差異、來源、實驗室條件和測定方法及測量儀器不同等因素，其基本生物學數據有一定的差異，為使我們的實驗數據解釋建立在客觀、可靠、準確的基礎上，可以為藥物生殖毒性非臨床安全性評價提供科學的依據，故各實驗室在研究開展前需要具備一套完整、清晰的背景數據，以保證實驗系統(tǒng)的正確和數據的可靠。為此，本文總結了2010-2018年在上海市計劃生育科學研究所（中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心）完成的10項SD大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗，對溶媒對照組在內的共計217 只孕鼠和2506只胎仔的數據進行收集和統(tǒng)計分析，初步建立了本中心大鼠胚胎-胎仔發(fā)育指標的背景數據，為藥物生殖毒性安全評價的開展和結果判斷提供重要數據支持。

1 材料與方法

1.1 動物和儀器

Sprague-Dawley（SD）雌性大鼠，SPF 級，60～80 日齡，健康性成熟未經交配生育的大鼠，體質量180～250 g（為開始交配時體質量），由上海市西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（滬）2008-0016 和SCXK（滬）2013-0016。SD 大鼠在上海市計劃生育科學研究所（中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心）SPF 級動物房內飼養(yǎng)（SYXK［滬］2008-0027 和SYXK（滬）2013-0027）。室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照12 h，黑暗12 h；實驗開始前動物適應性飼養(yǎng)至少5 d；塑料籠大小為400 mm×350 mm×200 mm，妊娠期間單籠飼養(yǎng)；自由飲水、攝食。PL-1501/S-01 電子天平和MS4002TSDR/00 電子天平（Mettler Toledo，瑞士）；Motic 體視顯微鏡（Olympus Corporation，日本）。

1.2 動物交配

大鼠接收后檢疫并適應性飼養(yǎng)5 d。在達到交配體質量要求后，雌鼠、雄鼠按2∶1（或1∶1）合籠交配，于當日下午16∶00 合籠，次日上午8∶00 以后陰道涂片檢查，查到精子或陰栓確定為妊娠當天（gestation day 0，GD0），第2 天為妊娠GD1，以此類推。

1.3 體質量和攝食量測定

孕鼠于GD0，GD3，GD6，GD10，GD13，GD15，GD18和GD20測定 體 質量并 記錄；記 錄GD0-1，GD6-7，GD13-14和GD19-20的攝食量。

1.4 剖宮檢查孕鼠

GD20安樂死母鼠取出胎仔，檢查黃體數、胎重（連子宮）、胎盤重、活胎數、死胎數（含吸收胎）、胎仔性別、胎重、身長、尾長及每只胎仔的外觀、內臟和骨骼，并數出著床數；將每窩1/2 胎鼠放入Bouin液固定，進行內臟檢查。另1/2進行骨骼檢查，首先將胎鼠去皮、去脂、去內臟，分別放入阿利新藍和茜素紅染液中染色，透明液Ⅰ和透明液Ⅱ分別透明胎仔骨骼。

1.5 胎仔的外觀檢查

對每只胎仔先經肉眼檢查，肉眼不能確定的畸形，在體視顯微鏡下確定。觀察指標包括：腦積水、露腦、腦疝、腦膜膨出、無眼、小眼、無耳和腭裂；多趾、并趾、少趾、無趾、足內翻和短趾；臍疝、腹裂、脊髓膨出、脊柱裂和脊柱側突；短尾、卷尾、無尾和尾分叉；肛門閉鎖。

1.6 胎仔的骨骼檢查

頭顱完整程度和骨化程度；胸骨節(jié)缺失、骨化不全、雙骨化點、胸骨節(jié)錯位、多肋、少肋、肋骨分叉、肋融合、波狀肋；四肢骨骨化不全、粗短、畸形、多趾和少趾等。

1.7 胎仔的內臟器官檢查

腭裂、舌異常、鼻道擴大、單鼻道、腦水腫、腎積水；眼球是否正常；心、肝、脾、肺、腎和子宮等臟器大小和位置。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對各項指標數據進行正態(tài)性分布檢驗，計算，確定95%可信區(qū)間和變異系數（coefficient of variation，CV）CV=s/x×100%。

2 結果

2.1 孕大鼠妊娠期體質量和攝食量的變化

妊娠期間母體的狀況如體質量和攝食量異常會直接影響胚胎的發(fā)育，因此母體的體質量和攝食量數據可以提供最直接和清晰的關于母體毒性的評估。對妊娠動物，宮外增重是比體質量更加敏感的指標。在大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中，測得孕大鼠妊娠各時期的體質量和攝食數據見表1 和表2。孕大鼠GD0的體質量為（222±22）g，GD20為（353±30）g。GD0-1為每只（18.9±3.8）g·d-1，GD19-20為每只（26.2±4.0）g·d-1。妊娠期體質量和攝食量隨妊娠時間的增加而穩(wěn)定增加。孕大鼠宮外增重GD20-GD6-胎重（連子宮）為（35.2±10.7）g。

Tab.1 Body mass of pregnant rats on different gestation days（GD）

Tab.2 Food consumption of pregnant rats on different GD

2.2 SD孕鼠生殖功能和胎仔的生長發(fā)育指標

GD20處死孕大鼠后，取出胎仔，檢查黃體數、胎重（連子宮）、胎盤重、活胎數和死胎數（含吸收胎），測量胎仔身長和尾長，檢測各項指標的數據見表3和表4。研究中有228 只雌鼠交配成功，有效妊娠數為217 只，妊娠率為95.2%；剖檢結果顯示，2561 例著床成功，其中活胎2506 例，吸收胎54例，死胎1 例。胎仔的發(fā)育指標中，胎盤重為（0.5±0.1）g，變異系數偏高為16.4%，由于個別孕大鼠妊娠的胎仔數少，導致宮內的胎仔發(fā)育較好，胎盤較大；胎仔體質量為（3.6±0.3）g，身長為（35.7±1.5）mm和尾長為（12.9±0.4）mm，變異系數較低，表明胎仔的發(fā)育比較穩(wěn)定。

2.3 胎仔外觀、內臟和骨骼檢查指標

在本中心檢查胎仔的外觀、內臟和骨骼發(fā)現，有4只胎仔出現外觀異常，分別為皮下出血（2例）、頭部淤血（1例）和細尾短小（1例）；胎仔的內臟檢查發(fā)現6 只胎仔的腎皮質和腎髓質出現棕色；胎仔的骨骼檢查主要表現為頂骨骨化不全33例，枕骨異常11例（其中枕骨骨化不全3例，枕骨Ⅰ級7例和枕骨Ⅱ級1例），胸骨異常4例（其中胸骨輕度裂開2例，胸骨發(fā)育不全偏位2 例），肋骨異常3 例（其中雙側肋骨與胸骨連接處不對稱2 例，與胸骨相連肋軟骨缺失1例），胸椎異常2例（其中第10胸椎點狀缺失1 例，第5-13 胸椎部分缺失1 例），腰椎部分缺失1例，骶椎異常2例（其中第4骶椎骨化不全1例，部分缺失1例），尾椎異常3例（其中第2尾椎不對稱骨化1例，第1尾椎左右側多骨化點2例）（表5和圖1）。

Tab.3 Reproductive index of pregnant rats at endpoint of experiment

Tab.4 Growth and development index of fetuses on cesarean section day

Tab.5 Examination of fetal appearance，viscera and skeleton

Fig.1 Variation of skeletal development in fetuses. A：normal rat fetus；B：sternebra incomplete ossification；C：2nd and 5th sternebra asymmetrically dumbbell-shaped；D：2nd caudal vertebra asymmetrical ossification；E：1st caudal vertebra multiple ossification；F：4th sacral vertebra incomplete ossification.

3 討論

在藥物開發(fā)過程中，生殖毒性研究的目的是通過動物試驗反映受試物對哺乳動物生殖功能和發(fā)育過程的影響，預測其可能產生的對生殖細胞、受孕、妊娠、分娩和哺乳等親代生殖功能的不良影響，以及對子代胚胎-胎兒發(fā)育、出生后發(fā)育的不良影響。其中胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗（即Ⅱ段）是妊娠動物自胚胎著床至硬腭閉合給藥，評價藥物對妊娠動物、胚胎和胎仔發(fā)育的影響。

實驗動物被稱為“活的試劑”，國內外公認其質量標準化直接影響科學研究水平的高低。藥物安全性評價中，藥物對SD大鼠胚胎-胎仔發(fā)育毒性實驗的評價是通過實驗組與對照組的妊娠體質量、攝食量、妊娠大鼠的生殖功能、胎仔的生長發(fā)育、胎仔的內臟和骨骼發(fā)育以及子宮平滑肌張力等指標的對比來研究毒性的作用部位、方式、損害性質與程度。而獲得正常的妊娠條件下的相關背景數據對實驗數據分析非常重要。

胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗中，在缺乏解剖學、組織病理學評估和器官重量測量的情況下，妊娠體質量和攝食量數據可以提供最直接和清晰的關于母體毒性的評估。本GLP實驗室的SD孕大鼠GD0體質量為（222±22）g，GD20為（353±30）g，而孔衛(wèi)青［3］和葉向峰等［4］研究的SD 孕大鼠GD0體質量分別為229±20 和（248±25）g，GD20分別為380±34和（400±35）g。體質量的測量結果可以用來區(qū)分其是來自給藥操作、應激還是藥物毒性的影響。由于灌胃等適口性改變而引起的攝食降低，繼發(fā)體質量降低現象［5］需要與攝食指標結合，以及自身實驗室建立的背景數據進行綜合分析。本GLP 實驗室也測量了孕大鼠每周的攝食量，觀察到攝食量隨孕期增長而逐漸增加，這與孔衛(wèi)青等［3］研究一致。對于妊娠動物來說，增重相比體質量來說是更加敏感的指標，可以發(fā)現早期短暫性的體質量減輕以及停藥后可能的恢復性增加現象。

黃體數、著床數、活胎數、吸收胎數和死胎數等指標是衡量胚胎早期和晚期發(fā)育毒性的重要指標，本GLP實驗室SD孕大鼠平均黃體數為（12.8±2.1）個，平均著床數為（11.8±2.8）個，平均活胎數為（11.5±2.8）只，活胎率為97.9%，而孔衛(wèi)青［3］和葉向峰等［4］的研究SD 孕鼠平均黃體數分別為15.6±2.8和（15.5±2.5）個，平均著床數分別為13.6±3.7 和（14.2±3.2）個，平均活胎數分別為12.8±3.7 和（13.4±3.5）只，活胎率分別為93.96%和97.8%。通過對比發(fā)現，各研究機構孕大鼠的平均黃體數、著床數和活胎數未見明顯差異。

胎仔、胎盤重、體長和尾長是評價藥物對胎仔的生長發(fā)育是否產生毒性的指標［6］。本GLP 實驗室胎仔發(fā)育指標中體長為（35.7±1.5）mm，尾長為（12.9±0.4）mm；而孔衛(wèi)青［3］和葉向峰等［4］的研究報道，胎仔體長分別為37.17±1.14和（33.8±2.4）mm，尾長分別為13.17±0.79 和（13.6±1.2）mm。對比發(fā)現，本實驗室與孔衛(wèi)青［3］和葉向峰等［4］的研究有輕微的差異，因為實驗動物品系、個體差異、來源、實驗室條件和測定方法及測量儀器不同等影響因素，均會產生不同的測量結果，故需不斷地動態(tài)觀察以積累數據。因此，建立實驗室內部的實驗背景數據可有效確保實驗系統(tǒng)的可靠性，為數據分析提供有力證據。

對胎仔進行外觀、內臟及骨骼檢查是進一步評價藥物對胎仔是否產生毒性的方法。本GLP 實驗室活胎仔檢查中，外觀變異率為0.2%，內臟變異率為0.5%，骨骼變異率為7.4%。對所有胎仔進行外觀檢查時應按一定順序，如從頭部到尾部的順序，必要時可使用輔助工具如放大鏡或顯微鏡。至少應對50%大鼠胎仔進行內臟檢查，應按照一定順序，一般從胸腔器官開始依次檢查至尾端。骨骼檢查前為了便于觀察應使骨骼或軟骨染色，常用染色方法有茜素紅單染法和茜素紅-阿利新藍雙染法，因茜素紅主要對骨化骨進行染色，阿利新藍主要對軟骨進行染色，因此雙染法對于評價骨化骨和軟骨來說是最佳選擇［7］。

胚胎-胎仔發(fā)育毒性試驗各指標背景數據的建立是藥物非臨床安全性評價的重要積累和評價基礎，通過自身實驗室需要不斷擴大自身的背景數據庫，使實驗數據解釋建立在客觀、可靠、準確的基礎上，從而可以更加準確地判定藥物毒性反應，為生殖毒性安全性評價提供更多參考。