六價(jià)鉻激活mTOR蛋白誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷

張英進(jìn)，宋梅芳，易宗娓，張?jiān)谄?，申向東，費(fèi) 嫦，楊 淵

（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，湖南 長(zhǎng)沙410011；2.湖南醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，侗醫(yī)藥湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 懷化418000；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院3.腎內(nèi)科，4.病理科，山西 長(zhǎng)治046000）

六價(jià)鉻〔hexavalent chromium，Cr（Ⅵ）〕是一種強(qiáng)上皮刺激物和致癌物，廣泛存在于鉻冶煉、電鍍、染料、油漆顏料和皮革鞣制的工業(yè)廢水中，可轉(zhuǎn)移到土壤或農(nóng)作物［1］。研究表明，腎上皮細(xì)胞對(duì)Cr（Ⅵ）的毒性反應(yīng)比肝上皮細(xì)胞更為敏感，腎可能是Cr（Ⅵ）致機(jī)體中毒的主要作用靶點(diǎn)［2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)成年大鼠急性腎損傷（acute kidney injury，AKI），表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞損傷、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥因子水平升高［3］及AKI生物標(biāo)志物如中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）［4］和腎損傷分子1（kidney injury molecule 1，Kim-1）［5］升高。AKI 如未得到及時(shí)治療，可快速進(jìn)展至終末期腎病，具有高死亡的潛在風(fēng)險(xiǎn)［6］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的重要信號(hào)通路，可于AKI后激活，參與腎組織炎癥及纖維化進(jìn)程［7］。近來(lái)發(fā)現(xiàn)，mTOR通路的激活與Cr（Ⅵ）的毒性效應(yīng)有關(guān)。例如，Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)小鼠肺組織中mTOR 信號(hào)通路上游信號(hào)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，Akt）的磷酸化激活［8］；雷帕霉素（rapamycin，Rap，西羅莫司）可誘導(dǎo)自噬，減輕Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷［9］。研究表明，Rap在缺血性AKI中具有抑制腎小管細(xì)胞增殖、延遲腎損傷修復(fù)的作用，在順鉑誘導(dǎo)的AKI 中具有誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和減輕腎損傷的雙重效應(yīng)［10］。迄今，Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)AKI 與mTOR 信號(hào)通路的關(guān)系研究報(bào)道較少，而Rap 作為mTOR 信號(hào)通路抑制劑，是否可對(duì)Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)的AKI 產(chǎn)生拮抗效應(yīng)尚不清楚。另外，N-乙?；?L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）是一種常用的抗氧化劑，研究證實(shí)，NAC 可清除體內(nèi)活性氧自由基，發(fā)揮腎保護(hù)效應(yīng)［11］。本研究擬探討Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)的大鼠AKI 作用、mTOR 通路變化特征以及Rap 或NAC 對(duì)大鼠AKI 的干預(yù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

Cr（Ⅵ）化合物鉻酸鈉（Na2CrO4）〔簡(jiǎn)稱Cr（Ⅵ）〕（天津風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，純度≥99.7%）；Rap和NAC（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；血清肌酐（serum creatinine，Scr）和NGAL ELISA 試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；谷胱甘肽（glutathione，GSH）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（南京碧云天生物技術(shù)有限公司）；兔抗大鼠磷酸化mTOR（phospho-mTOR，p-mTOR）多克隆抗體（PAB25827，英國(guó)Abnova 公司）；兔抗大鼠磷酸化-p70 核糖體蛋白S6 激酶（phosphorylated p70 ribosomal protein S6 kinase，p-p70S6K）多克隆抗體（MBS462099，美國(guó)MyBioSource 公司）；兔抗大鼠活化的胱天蛋白酶3 多克隆抗體（AB3623，德國(guó)Merck Millipore公司）；抗大鼠β肌動(dòng)蛋白單克隆抗體和山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶IgG 抗體（K200058M，北京索萊寶科技有限公司）。Chemi-Doc Touch Imaging 蛋白電泳免疫印跡系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；M200 PRO 多功能酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；Eppendorf 5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 動(dòng)物

42 只雄性SD 大鼠，10～11 周齡，體質(zhì)量274～306 g，由湖南長(zhǎng)沙斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)SCXK（湘）2014-0002，飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫20～24℃，相對(duì)濕度50%～70%，晝夜明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.3 動(dòng)物分組和藥物處理

大鼠隨機(jī)分為7組：正常對(duì)照組（單次ip給予生理鹽水，2 mL·kg-1）；Cr（Ⅵ）處理組〔單次ip給予Cr（Ⅵ）5或10 mg·kg-1〕［12］；Rap干預(yù)組〔隔日1次（共4次）ip 給予Rap 2 mg·kg-1，末次給藥6 h 后，單次ip 給予Cr（Ⅵ）5 或10 mg·kg-1〕［13］；NAC 干預(yù)組〔連續(xù)3 d，每日1次（共3次）ip給予NAC 300mg·kg-1，末次給藥6 h后，單次ip給予Cr（Ⅵ）5或10 mg·kg-1〕［14］。Cr（Ⅵ）處理48 h后，收集血液和尿液，乙醚麻醉處死大鼠，稱取體質(zhì)量和腎質(zhì)量，計(jì)算腎系數(shù)〔腎系數(shù)=腎質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100〕；腎組織用PBS沖洗后置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ELlSA法檢測(cè)大鼠Scr和尿NGAL水平

將尿液樣品以4℃，400×g離心5 min，取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)尿中NGAL水平。血液樣品經(jīng)4℃、1000×g離心10 min取上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)Scr水平。

1.5 HE染色觀察腎小管病理?yè)p傷

取部分1.3收集的腎皮質(zhì)，經(jīng)4%多聚甲醛固定72 h 后，用石蠟包埋，制備5 μm病理切片，常規(guī)HE染色。在顯微鏡下觀察腎小管病理變化，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，采用AutoCAD軟件計(jì)算損傷面積百分比（即腎小管損傷面積占視野面積百分比）［15］。

1.6 紫外分光光度法檢測(cè)腎皮質(zhì)GSH和MDA含量

將1.3 收集的腎皮質(zhì)組織以1∶9（m/V）加入PBS 進(jìn)行勻漿，組織勻漿液經(jīng)過(guò)3 次凍融以裂解細(xì)胞后，經(jīng)1000×g，4℃離心5 min，收集上清液。參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用紫外分光光度法測(cè)定每克腎組織中GSH或MDA含量。

1.7 Western印跡法檢測(cè)腎皮質(zhì)p-mTOR、p-p70S6K和活化胱天蛋白酶3表達(dá)水平

將1.3收集的腎皮質(zhì)加入100 μL細(xì)胞裂解液以充分裂解組織細(xì)胞，4℃，3000×g 離心5 min 取上清，用BCA 法測(cè)總蛋白濃度；總蛋白加上樣緩沖液混勻，煮沸變性，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h；加一抗〔p-mTOR（1∶1000）、p-p70S6K（1∶1500）、活化的胱天蛋白酶3（1∶800）、β肌動(dòng)蛋白（1∶400）〕；4℃下孵育16 h，TBS-T 洗膜3 次，每次10 min；室溫下用二抗（1∶10 000）孵育2 h；洗膜后加ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯影，凝膠成像儀采集圖像，積分吸光度（integral absorbance，IA）采用LI-COR Odyssey圖像處理軟件定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白IA值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)用表示。組間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異比較運(yùn)用單因素方差分析及t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rap和NAC對(duì)Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)AKl大鼠腎質(zhì)量和腎系數(shù)的影響

如表1 所示，與正常對(duì)照組比較，Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1組大鼠腎質(zhì)量和腎系數(shù)明顯增加（P＜0.05），Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1組相比，Rap+Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1組腎質(zhì)量明顯降低（P＜0.05），腎系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而NAC+Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1組體質(zhì)量、腎質(zhì)量和腎系數(shù)變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Rap 和NAC 對(duì)Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)AKl 大鼠Scr 和尿NGAL及腎皮質(zhì)GSH和MDA含量的影響

如表2 所示，與正常對(duì)照組相比，不同劑量Cr（Ⅵ）組大鼠Scr、尿NGAL和MDA水平均明顯升高（P＜0.05），腎皮質(zhì)GSH含量明顯降低（P＜0.05）。分別與同劑量Cr（Ⅵ）處理組相比，Rap干預(yù)組Scr、尿NGAL和MDA水平明顯下調(diào)（P＜0.05），GSH含量明顯升高（P＜0.05）；NAC 干預(yù)組Scr 和MDA 水平明顯下調(diào)（P＜0.05），GSH含量明顯升高（P＜0.05），而尿NGAL 水平無(wú)明顯差異。分別與NAC+Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1組或NAC+Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1組比較，Rap+Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1組或Rap+Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1組Scr和GSH水平明顯較低（P＜0.05），而尿NGAL和MDA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Rap和NAC對(duì)Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)AKl大鼠腎皮質(zhì)病理結(jié)構(gòu)的影響

HE染色結(jié)果顯示（圖1），不同劑量Cr（Ⅵ）組大鼠腎小管組織細(xì)胞呈空泡樣改變、腫脹破裂，管腔內(nèi)紅染等病理改變，腎小管損傷面積百分比分別為（36.5±4.5）%和（46.3±5.2）%，明顯高于正常對(duì)照組（1.9±0.35）%（P＜0.05）。分別與同劑量Cr（Ⅵ）組比較，Rap或NAC干預(yù)組腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)顆粒樣變或空泡樣變性程度均明顯減輕，腎小管損傷面積百分比分別顯著降低（P＜0.05）。與NAC干預(yù)組相比，Rap干預(yù)組腎小管損傷面積百分比明顯降低（P＜0.05）。

Tab.1 Effect of rapamycin（Rap）and N-acetyl-L-cysteine（NAC）on kidney mass and kidney coefficient of hexavalent chromium〔Cr（Ⅵ）〕-induced acute kidney injury（AKl）in rats

Tab.2 Effect of Rap and NAC on neutrophil gelatinase-associated lipocalin（NGAL），glutathione（GSH），malondialdehyde（MDA）and serum creatinine（Scr）in Cr（Ⅵ）-induced AKl in rats

Fig.1 Effect of Cr（Ⅵ）on histopathology and tubular injury areas of renal tissues in rats (HE staining). See Tab.1 for the rat treatment. A：HE staining depicting renal tissue morphology. White arrow indicates the characteristics of vacuolated changes, swelling or rupture occurred in tubular epithelial cell cytosolis； blue arrows indicate the characteristics of granular degeneration or balloon like changes in tubular epithelial cells.Nuclei were dyed blue，cytoplasm and extracellular matrix dyed to different shades of red. B was the semi-quantitative result of A. Percentage of renal tubular injury area (%)=tubular injury area/total area of view fields×100%. n=6. ＊P＜0.05, compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1 group；△P＜0.05，compared with Cr（Ⅵ）10 group；▲P＜0.05，compared with NAC+Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1group；▽P＜0.05，compared with NAC+Cr（Ⅵ）10 mg·kg-1 group.

2.4 Rap 和NAC 對(duì)Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)AKl 大鼠腎皮質(zhì)p-mTOR、p-p70S6K 和活化的胱天蛋白酶3 水平的影響

與正常對(duì)照組相比，不同劑量Cr（Ⅵ）組大鼠p-mTOR、p-p70S6K和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）。分別與同劑量Cr（Ⅵ）處理組相比，Rap 干預(yù)組或NAC 干預(yù)組大鼠p-mTOR、p-p70S6K 和活化的胱天蛋白酶3 表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.05）。與NAC 干預(yù)組相比，Rap 干預(yù)組大鼠p-mTOR、p-p70S6K和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）（圖2）。

Fig.2 Effect of Cr（Ⅵ）on protein expressions of phosphorylated mammalian target of rapamycin(p-mTOR), phosphorylated-p70 ribosomal protein S6 kinase (p-p70S6K) and cleaved-caspase 3 in renal cortiex. See Tab.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A. IA：integrated absorbance. n=6.＊P＜0.05,compared with normal control group；#P＜0.05，compared with Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1 group；△P＜0.05，compared with Cr（Ⅵ）10 group；▲P＜0.05，compared with NAC+Cr（Ⅵ）5 mg·kg-1 group；▽P＜0.05，compared with NAC+Cr（VI）10 mg·kg-1 group.

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道，Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)大鼠AKI，主要表現(xiàn)為Scr和血清尿素氮水平升高，抗氧化劑GSH、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶水平降低，以及促凋亡酶胱天蛋白酶3 激活［16］。AKI 腎組織病理特點(diǎn)以腎小管損傷為主，表現(xiàn)為腎小管管腔變小、管型形成，刷狀緣微絨毛損壞或脫落，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)濁腫、變性和壞死等特征［17］。一些研究發(fā)現(xiàn)，非特異性β-腎上腺素能受體阻滯劑卡維地洛（carvedilol）［16］和抗氧化劑硒［18］可恢復(fù)腎組織抗氧化物和線粒體呼吸酶活性，降低腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化水平，從而減輕Cr（Ⅵ）導(dǎo)致的腎毒性。另一些研究發(fā)現(xiàn)，mTOR通路抑制劑依維莫司（everolimus）或鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅳ通過(guò)誘導(dǎo)自噬激活，在順鉑、缺血再灌注或內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的AKI中具有保護(hù)作用［19-20］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，Rap是mTOR信號(hào)通路抑制劑，在順鉑誘導(dǎo)的AKI中，Rap可通過(guò)增加腎皮質(zhì)組織中自噬小體標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ表達(dá)水平，激活腎組織細(xì)胞自噬而發(fā)揮AKI保護(hù)作用［21］；在衣霉素（tunicamycin）誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型中，Rap 可通過(guò)抑制蛋白激酶R 類似內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、真核起始因子2α 磷酸化激活，抑制CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 的活化，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活［22］。目前，mTOR信號(hào)通路與Cr（VI）誘導(dǎo)急性腎毒性的關(guān)系及Rap 在其中扮演的角色尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，Cr（Ⅵ）5 和10 mg·kg-1均可誘導(dǎo)大鼠AKI 和mTOR 通路激活，表現(xiàn)為Scr 和尿NGAL 水平、腎小管損傷面積百分比、腎組織p-mTOR、p-p70S6K和活化的胱天蛋白酶3表達(dá)水平明顯升高。而Rap或NAC預(yù)處理均可使Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)AKI 程度明顯減輕，表現(xiàn)為上述指標(biāo)明顯下調(diào)。此外，Rap 干預(yù)組與NAC 干預(yù)組比較，前者Scr、腎小管病理?yè)p傷面積百分比、腎組織p-mTOR、p-p70S6K 和活化的胱天蛋白酶3 表達(dá)水平明顯低于后者，氧化應(yīng)激標(biāo)志物MDA 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)大鼠腎組織mTOR通路磷酸化和胱天蛋白酶3依賴的細(xì)胞凋亡途徑激活，Rap或NAC預(yù)處理對(duì)上述改變具有明顯抑制效應(yīng)，而相比于NAC，Rap 對(duì)Cr（Ⅵ）腎毒性的拮抗效應(yīng)更明顯。

mTOR 通路屬于細(xì)胞內(nèi)Akt 信號(hào)通路，一些功能蛋白如AMP活化的蛋白激酶、胰島素樣生長(zhǎng)因子1和轉(zhuǎn)錄因子p53等可誘導(dǎo)mTOR通路激活，從而促進(jìn)細(xì)胞周期G到S期的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞增殖與抑制細(xì)胞自噬。而抑制mTOR通路蛋白活性，可抑制下游靶蛋白p70S6K 和真核起始因子4E 結(jié)合蛋白1磷酸化激活，導(dǎo)致基因—蛋白質(zhì)翻譯減少，從而抑制細(xì)胞增殖和激活細(xì)胞自噬［23-24］。有文獻(xiàn)報(bào)道，Rap 可抑制mTOR 信號(hào)通路和激活細(xì)胞自噬，對(duì)Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)的體外肝細(xì)胞毒性具有保護(hù)作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)AKI和引起mTOR通路激活，Rap 干預(yù)可抑制mTOR 通路蛋白磷酸化激活，有效拮抗Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)的AKI，且Rap 組的腎損傷改善效應(yīng)優(yōu)于NAC干預(yù)組。研究還發(fā)現(xiàn)，Rap干預(yù)組和NAC干預(yù)均表現(xiàn)出抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，可明顯逆轉(zhuǎn)Cr（Ⅵ）導(dǎo)致的GSH 減少和MDA 升高。該結(jié)果提示，NAC 預(yù)處理可明顯提高大鼠體內(nèi)GSH 水平，降低Cr（Ⅵ）導(dǎo)致大鼠腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)，而Rap干預(yù)的抗氧化應(yīng)激可能與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控有關(guān)。既往研究表明，Rap 干預(yù)可通過(guò)減少一氧化氮和超氧化物生成，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)促凋亡分子CHOP 的活性，減少細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素c 釋放和保護(hù)線粒體功能，對(duì)小鼠心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［25］。

綜上，本研究證實(shí)，Cr（Ⅵ）可誘導(dǎo)大鼠AKI 及mTOR通路激活，Rap干預(yù)可有效拮抗Cr（Ⅵ）導(dǎo)致的AKI。推測(cè)Rap 抑制mTOR 通路激活和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，上調(diào)腎組織細(xì)胞自噬水平和改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的促凋亡效應(yīng)可能是其拮抗Cr（Ⅵ）急性腎毒性的分子機(jī)制。目前，Cr（Ⅵ）誘導(dǎo)大鼠AKI 過(guò)程中Rap 對(duì)mTOR 通路與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路上、下游因子的影響，以及Rap 干預(yù)后腎小管組織細(xì)胞自噬水平的動(dòng)態(tài)特征有待進(jìn)一步探討。