大豆-乳清混合蛋白對O/W乳液穩(wěn)定性及流變性的影響

李 良 張小影 朱建宇 韓 璐 李 楊,2 齊寶坤,2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院， 哈爾濱 150030； 2.國家大豆工程技術(shù)研究中心， 哈爾濱 150030)

0 引言

乳液是由油、水和乳化劑形成的熱不穩(wěn)定體系，具有不同的類型，廣泛存在于工業(yè)化生產(chǎn)及日常生活中，如牛奶、冰激凌、藥品、化妝品等。乳液的穩(wěn)定性在其應用中起著至關(guān)重要的作用，乳液組分的性質(zhì)，如蛋白質(zhì)的種類及性質(zhì)、蛋白濃度、油相濃度等，都容易影響乳液的穩(wěn)定性[1]。大豆分離蛋白(SPI)是一種營養(yǎng)豐富的食用蛋白資源，由于其蛋白含量較高，具有良好的乳化性，研究者將SPI作為乳化劑來穩(wěn)定乳液[2]。單一的SPI由于受結(jié)構(gòu)影響容易變質(zhì)等問題，限制了其在乳液中作為乳化劑的應用。

乳清蛋白分離物(WPI)具有營養(yǎng)價值高、易消化、生物利用度高和多種生物活性等特點，是乳制品行業(yè)中制造增值產(chǎn)品的重要成分[3]。WPI具有兩親性，可以結(jié)合靜電和空間相互作用，穩(wěn)定乳液，防止絮凝或聚結(jié)，從而為油滴提供保護[4]。因此，乳清分離蛋白可用作乳化劑來提高乳液的穩(wěn)定性。王喜波等[5]研究了超聲處理改善不同比例大豆-乳清混合蛋白理化性質(zhì)，但是沒有說明濃度與比例對乳液穩(wěn)定性及流變特性的影響。JOSE等[6]研究了混合乳清和大豆蛋白凝膠機械反應和保水的結(jié)果，結(jié)果表明混合蛋白比單一蛋白效果好。

本文采用大豆分離蛋白-乳清分離蛋白(SPI-WPI)作為復合乳化劑，來提高O/W(水包油)乳液的穩(wěn)定性。通過測定粒徑、Zeta電位、乳液穩(wěn)定性系數(shù)、掃描電鏡、流變等指標，探討質(zhì)量分數(shù)及混合蛋白比例對復合乳液穩(wěn)定性及流變特性的影響，以確定最優(yōu)的蛋白濃度和混合比例，從而為提高乳液穩(wěn)定性和其應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清分離蛋白(WPI-90)，南京松冠生物科技有限公司；大豆分離蛋白(SPI)，哈高科大豆食品有限責任公司；大豆油(九三一級壓榨油)，九三集團哈爾濱惠康食品有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)，沈陽市騰誠化工原料有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FJ-200型高速分散均質(zhì)機，上海標本模型廠；FB-110S型超高壓均質(zhì)機，上海勵途機械設備工程有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；NANO-ZS90型馬爾文激光粒度儀，英國馬爾文公司；UV-2550型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；食品氧化穩(wěn)定性分析儀(OXITEST)，意大利VELP公司；SU8010型冷凍掃描電鏡，日立高新技術(shù)公司；DHR-1型流變儀，美國TA儀器公司；HAAKE MARS 40型旋轉(zhuǎn)流變儀，德國RHEOTEST公司。

1.3 實驗方法

1.3.1雙蛋白乳液的制備

將SPI與WPI分別按照1∶9、5∶5、9∶1質(zhì)量比[6]混合作為實驗組，以單獨添加SPI為對照組。將混合物溶于100 mL去離子水中，使蛋白溶液質(zhì)量分數(shù)分別達到1.5%、2.0%、2.5%，磁力攪拌1 h使其充分溶解，4℃貯藏備用。

將雙蛋白溶液與大豆油混合，制成初級乳狀液，使得大豆油占15%，混合蛋白溶液占1.5%、2.0%、2.5%。并利用高速剪切機剪切3 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min。繼續(xù)利用高壓均質(zhì)機在60 MPa條件下均質(zhì)3次，制成最終乳狀液，再加入0.02%的疊氮化鈉以抑制微生物的生長，所得乳液在4.0℃下儲存[7]。

1.3.2粒徑與Zeta電位的測量

采用NANOA-ZS90型激光粒度分布儀測定乳液液滴粒徑與Zeta電位，將不同條件下制備的蛋白乳液稀釋1 000倍，乳液液滴的折射率為1.46，水分散介質(zhì)的折射率為1.33[8]。將樣品放入樣品池中，在25℃條件下測定體積平均粒徑D4，3。

1.3.3乳化活性與乳化穩(wěn)定性

參照文獻[9]的方法，吸取乳液20 μL，將其加入到4 mL 0.1% SDS溶液中混合均勻。在500 nm波長下測定吸光度A0，靜置30 min后測定吸光度A30，乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)計算公式為

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指數(shù)，m2/g

ESI——乳化穩(wěn)定性指數(shù)，min

N——稀釋倍數(shù)，取200

C——乳狀液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/mL

φ——乳狀液中油相體積分數(shù)，取15%

1.3.4乳液穩(wěn)定性系數(shù)

取2 mL乳液于圓底離心管中，4 000 r/min離心30 min，離心后在距離心管底部1 cm處取少量清液，裝入比色皿中，用紫外分光光度計測定離心前后乳液在500 nm波長處的吸光度[10]。乳液穩(wěn)定性系數(shù)(FI)公式為

(3)

式中At——離心后乳液吸光度

1.3.5乳液氧化穩(wěn)定性

采用OXITEST法，利用OXITEST氧化穩(wěn)定性分析儀測定乳液氧化穩(wěn)定性，將準備好的不同條件的乳液加入到樣品盤中，左、右各3個樣品盤，每個盤中稱量10.00 g乳液，溫度設定為90℃，壓力設定為6.00 MPa，觀測氧化曲線，計算乳液氧化誘導期[11]。

1.3.6液滴微觀分布

采用低溫掃描電鏡對SPI-WPI復合乳液的微觀結(jié)構(gòu)進行表征。將樣品液滴置于試樣支架上，在液氮中冷凍，并轉(zhuǎn)移到制備室(PP3010T型低溫冷凍電鏡制備系統(tǒng))。在破碎和升華之后，樣品表面噴金，然后用JSM-7100型掃描電子顯微鏡拍照[12]。

1.3.7乳液流變測定

利用DHR-1型流變儀測定不同濃度及比例的雙蛋白乳液穩(wěn)態(tài)流變性質(zhì)，取1.00 mL乳液置于樣品測試臺上，溫度設置為25℃，采用60.00 mm平行板夾具，狹縫距離設置為0.5 mm，剪切速率為0～100 s-1，測定樣品的流變特性[13]。

使用HAAKE MARS 40型旋轉(zhuǎn)流變儀，在實驗臺上取1.00 mL乳液加在測試臺上，溫度設定為25℃，以2℃/min的速度升溫至95℃，檢測整個降溫過程乳液體系的模量變化。采用60.00 mm平行板夾具，狹縫距離設置為0.50 mm，頻率為1.00 Hz，應力為0.050 Pa，在整個實驗過程中，需加蓋密封圈以防止水分過度蒸發(fā)，進行小變形振蕩掃描分析[13]。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復3次，結(jié)果表示為平均值±標準差。采用SPSS 18.5軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA差異顯著性分析，以p<0.05為差異顯著。采用Origin 8.5軟件進行制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳液粒徑和Zeta電位

粒徑是評價乳液穩(wěn)定的重要因素，液滴粒徑越小，乳析速度越慢，乳液越穩(wěn)定[5]。根據(jù)新鮮乳液的粒徑來評估SPI-WPI乳液的乳化性，結(jié)果如表1所示。實驗組與SPI對照組相比，實驗組的粒徑全部要比對照組小。這說明加入了WPI，乳液穩(wěn)定性有所提高，可能是因為形成SPI-WPI復合物，產(chǎn)生抑制液滴聚集的空間位阻作用。隨著蛋白質(zhì)量分數(shù)由1.5%增加至2.0%時，液滴D4,3減小，這可能因為油滴表面吸附蛋白質(zhì)含量增大，足以包埋油滴表面，乳液穩(wěn)定性增強[14]，隨后蛋白質(zhì)量分數(shù)從2.0%增加至2.5%時，液滴D4,3增大，說明達到蛋白濃度最佳后繼續(xù)增加濃度，反而使得兩種蛋白吸附在油滴表面的量少不足以包埋油滴表面，乳液穩(wěn)定性降低；隨著SPI與WPI質(zhì)量比由1∶9增加至9∶1，D4,3呈增大的趨勢，質(zhì)量比為1∶9時，蛋白相互作用達到最佳，乳液穩(wěn)定性較好。當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為2.0%、比例為1∶9時乳液D4,3最小，為(288.56±1.67)nm，表明適度的蛋白濃度及比例形成的乳液液滴D4,3較小，可能由于WPI添加量增加、SPI添加量相對減少，使得混合蛋白更容易吸附在乳液表面，復合物之間產(chǎn)生空間位阻作用，抑制了乳液液滴之間相互作用，有利于提高乳液的穩(wěn)定性[15]。相反，當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為1.5%、SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1時乳液D4,3最大，為(376.63±2.20)nm。

表1 不同條件下乳液的體積平均粒徑D4,3Tab.1 Volume average diameter of emulsion under different conditions nm

注：同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同。

圖1 不同條件下乳狀液的Zeta電位Fig.1 Zeta potential of emulsions under different conditions

Zeta電位是判斷分散體系穩(wěn)定性的重要指標，Zeta電位在一定程度上可以反映乳液液滴之間相互作用的強度。Zeta電位的絕對值越大，說明液滴間斥力越大，避免液滴聚結(jié)變大，體系越穩(wěn)定[16]。不同蛋白濃度和比例制備乳液結(jié)果如圖1(圖中不同字母表示差異顯著(p<0.05)，下同)所示。SPI-WPI復合乳液液滴表面帶有負電荷，實驗組Zeta電位絕對值比SPI對照組絕對值大。蛋白質(zhì)量分數(shù)由1.5%增加至2.0%時，SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時，Zeta電位絕對值由25.0 mV增加至35.0 mV，達到最大，產(chǎn)生的靜電斥力大[17]。蛋白質(zhì)量分數(shù)增加至2.5%時，Zeta電位絕對值為32.5 mV，表示乳液穩(wěn)定性較好，在此濃度下可能更多的SPI-WPI蛋白被吸附到乳液液滴的表面上，提高Zeta電位絕對值及增大油滴的表面電荷，這有助于增加液滴間的排斥力并防止液滴聚集，提高乳狀液體系的穩(wěn)定性；隨著SPI與WPI質(zhì)量比的逐漸增加，Zeta電位絕對值逐漸降低，質(zhì)量比為1∶9時Zeta電位絕對值最大，比例為9∶1時Zeta電位絕對值最小。綜上所述，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時，Zeta電位絕對值最大為35.0 mV，說明此時顆粒之間的靜電斥力最大，體系中分子不易聚集[18]，穩(wěn)定性最好，此結(jié)果與乳液液滴體積平均粒徑一致。

2.2 乳化活性和乳化穩(wěn)定性分析

影響混合體系乳化性的因素有很多，如SPI與WPI的結(jié)合程度、分子顆粒分布、蛋白質(zhì)空間構(gòu)象等[19]。不同條件制備乳液的乳化活性指數(shù)(EAI)和乳化穩(wěn)定性指數(shù)(ESI)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，實驗組EAI和ESI數(shù)值都比SPI對照組高，可能由于WPI的加入使蛋白質(zhì)分子間的靜電相互作用增強。隨著蛋白濃度的增加，乳液的EAI先增加后降低，隨著質(zhì)量比例的增加，乳液的EAI逐漸降低。其中，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時的乳液EAI最大，為108.23 m2/g，因為此條件下乳液的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用顯著增加，從而減緩由于重力或布朗運動造成的液滴聚結(jié)、絮凝等不穩(wěn)定現(xiàn)象的發(fā)生[20]。蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.5%、SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1的乳液EAI最小，為59.07 m2/g。SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時的乳液EAI更高，說明雖然SPI添加量相對較少，但添加WPI越多，乳液的EAI越好，WPI對乳液的EAI貢獻更大。隨著蛋白濃度的增加，乳液的ESI呈先上升后降低的趨勢；隨著質(zhì)量比的增加，乳液的ESI逐漸降低。其中，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%、比例為1∶9的乳液ESI最大，為3 784.71 min。蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.5%、比例為9∶1的乳液ESI最小，為1 394.40 min，乳液的乳化穩(wěn)定性較好。其他條件下，乳液的穩(wěn)定性降低，可能由于乳液液滴之間相互作用出現(xiàn)分層、脂肪上浮等現(xiàn)象。

圖2 不同條件下乳液的EAI和ESIFig.2 EAI and ESI of emulsions under different conditions

2.3 乳液穩(wěn)定性系數(shù)

圖3 不同條件下乳液的穩(wěn)定性系數(shù)Fig.3 Stability coefficient of emulsions under different conditions

不同條件制備乳液的穩(wěn)定性系數(shù)如圖3所示。結(jié)果表明，隨著蛋白濃度逐漸增加，SPI-WPI復合乳液的穩(wěn)定性系數(shù)呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢。實驗組1∶9的乳液穩(wěn)定性系數(shù)最高，乳液液滴粒徑小，分散均勻，穩(wěn)定性高。隨著SPI與WPI質(zhì)量比的增加SPI-WPI復合乳液的穩(wěn)定性系數(shù)逐漸降低。在蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%，SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9的條件下，SPI-WPI復合乳液的穩(wěn)定性系數(shù)最大，為93.59%，乳液穩(wěn)定性較好，可能是因為此條件下蛋白濃度和比例適宜，蛋白質(zhì)吸附至兩相界面較多，并降低界面張力，促使液滴形成，并起到油滴保護膜的作用，防止油滴被破壞，使乳狀液處于穩(wěn)定狀態(tài)[14]。而在蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.5%，SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1 的條件下，SPI-WPI復合乳液的穩(wěn)定性系數(shù)最小，為74.40%，乳液穩(wěn)定性與其他條件相比較差，可能由于蛋白質(zhì)量分數(shù)過量，達到飽和后多余的蛋白由于彼此間的電荷排斥反而會破壞乳狀液的穩(wěn)定性[21]。一定條件下，蛋白濃度的增加，如本文中蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%，會增加兩種蛋白粒子碰撞的機會，促進兩種蛋白粒子相互作用進而影響粒子間的相對距離，使混合蛋白穩(wěn)定性增強，這與文獻[21]研究結(jié)果一致。此結(jié)果與本文乳化活性數(shù)據(jù)一致。

2.4 乳液氧化穩(wěn)定性

圖4 不同條件下乳液的微觀狀態(tài)Fig.4 Microscopic state of emulsions under different conditions

油脂氧化穩(wěn)定性與產(chǎn)品的貨架期密切相關(guān)，通過預測產(chǎn)品氧化穩(wěn)定性可評估產(chǎn)品的貨架期[11]，誘導期越長，說明乳液越穩(wěn)定。乳液油脂氧化程度如表2所示。由表2可以看出實驗組1∶9時比對照組誘導期更長，乳液更穩(wěn)定，表明添加WPI有增加乳液穩(wěn)定性的作用，可能由于單獨SPI氧化較嚴重，產(chǎn)生較多的揮發(fā)性二級氧化產(chǎn)物。蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9的乳液誘導期最長，為(581±2) min，說明此時的乳液是比較穩(wěn)定的，表明提高WPI濃度及添加比例，SPI添加比例相對較少時，有利于抑制乳液油脂氧化，這與文獻[22]的研究結(jié)果一致。蛋白質(zhì)量分數(shù)為1.5%的乳液誘導期為(579±2) min，蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.5%、SPI與WPI質(zhì)量比9∶1的乳液誘導期最短，為(432±4) min，表明此時的乳液相對于其他條件下的乳液較不穩(wěn)定。

2.5 掃描電子顯微鏡

掃描電鏡(SEM)常用于分析乳液的微觀結(jié)構(gòu)，它能直接反映乳液顆粒尺寸、分散性和不穩(wěn)定性。

表2 乳液氧化誘導期Tab.2 Oil oxidation of emulsion min

圖4分別是對照組及實驗組乳液液滴的微觀分布狀態(tài)。由圖4可知，SPI-WPI復合乳液液滴是球形，表面光滑，這與文獻[6]等研究結(jié)果類似。實驗組的分散情況及液滴尺寸大小較對照組相比較好。隨著蛋白濃度的增加，液滴尺寸先減小后增大。隨著SPI與WPI質(zhì)量比的增加，液滴尺寸逐漸增大且出現(xiàn)液滴聚集的現(xiàn)象。當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時，可以看出乳液液滴尺寸較小且分布均勻。這可能是由于復合物濃度適宜且添加WPI量多在油-水界面形成更加致密的膜結(jié)構(gòu)[23]。當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為1.5%、SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1時，可以看出乳液液滴尺寸較大且分布聚集，形成乳液的界面膜不夠穩(wěn)定，發(fā)生了油滴之間的聚集或絮凝[24]，此現(xiàn)象證實了用馬爾文激光粒度儀測定的粒徑結(jié)果。

2.6 乳液流變分析

2.6.1乳液穩(wěn)態(tài)流變

圖5 不同條件下乳液的剪切速率對粘度及應力的影響Fig.5 Effects of shear rate of emulsion on viscosity and stress under different conditions

流變學是研究物質(zhì)在外力作用下變形和流動的科學，根據(jù)流變曲線形狀，流體可分為牛頓流體和非牛頓流體兩類。非牛頓流體的粘度不僅取決于溫度，還取決于剪切速率和剪切應力，它又可分為膨脹型流體、塑性流體及假塑性流體等主要類型[25]。不同條件下乳液的剪切速率對粘度及應力結(jié)果如圖5所示，乳液的粘度隨著剪切速率的增加而降低，表現(xiàn)出剪切稀釋現(xiàn)象，屬于假塑性流體。這與文獻[26]研究結(jié)果類似。對照組比實驗組1∶9、5∶5的粘度及應力大，但是遠不如實驗組9∶1的大，可能是因為加入了WPI，其與SPI混合，發(fā)生相互作用。隨著蛋白質(zhì)量分數(shù)的增加，乳液的粘度和應力先增加后下降。當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為1.5%～2.0%時，液滴表面吸附的蛋白量較少，乳液出現(xiàn)絮凝現(xiàn)象，粘度和應力增加，當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)達到2.5%，表面蛋白吸附量達到飽和，液滴帶同種電荷，互相排斥，粘度和應力減小。隨著SPI與WPI質(zhì)量比增加，乳液粘度和應力逐漸增加，說明乳清分離蛋白加入量多，有助于乳液粘度和應力的提高。其中，當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1時，乳液的粘度和應力最大，當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為2.5%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時，乳液的粘度和應力最小，原因可能是凝集狀態(tài)的油滴在剪切過程中相互分離[27]。但總體上乳液的粘度和應力都較低，乳液呈現(xiàn)流體狀態(tài)。

2.6.2乳液動態(tài)流變

乳液的粘彈性可以用儲能模量G′和損失模量G″來表征，SPI-WPI復合乳液的溫度對乳液儲能模量(G′)及損耗模量(G″)的影響見圖6。由圖可知，乳液的G′隨著溫度的增加而緩慢增加。實驗組比對照組高，可能是由于添加WPI，WPI的彈性較好，使混合蛋白彈性模量增加。隨著蛋白質(zhì)量分數(shù)的增加，乳液的G′及G″先增加后下降。隨著SPI與WPI質(zhì)量比增加，乳液G′及G″逐漸增加。其中，當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1時，乳液的G′及G″最大，當?shù)鞍踪|(zhì)量分數(shù)為2.5%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時，乳液的G′及G″最小。乳液的G′及G″隨著溫度的升高(70℃以下)而降低，這表明保持乳液蛋白結(jié)構(gòu)的強度降低，并且維持乳液蛋白結(jié)構(gòu)的力是一些比較弱的作用力，如氫鍵。而溫度從70℃升到95℃又逐漸增大，這很可能是由于蛋白開始變性和結(jié)構(gòu)進一步展開，這也表明，隨著溫度升高，有更多的蛋白和蛋白包裹油滴進入乳液網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)中[28]。

圖6 不同條件下乳液的溫度對彈性模量及損耗模量的影響Fig.6 Effects of temperature of emulsion on modulus of elasticity and modulus of loss under different conditions

3 結(jié)論

(1)添加WPI改變了乳液的穩(wěn)定性和流變特性，說明蛋白質(zhì)量分數(shù)及兩種蛋白質(zhì)的質(zhì)量比對乳液穩(wěn)定性及流變特性有顯著影響。

(2)當SPI-WPI乳液質(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為1∶9時，乳狀液穩(wěn)定性、乳化性、微觀狀態(tài)、氧化穩(wěn)定性最好。

(3)當SPI-WPI乳液蛋白質(zhì)量分數(shù)為2.0%、SPI與WPI質(zhì)量比為9∶1時，乳狀液的流變特性最好，乳液粘度及剪切應力呈現(xiàn)最大值。