犀角散對(duì)肝衰竭小鼠肝臟固有免疫的影響*

林暉明 吳中華 尹燕耀

1.深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院肝病科 (廣東 深圳, 518000) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)

肝衰竭是臨床常見具有極高病死率的嚴(yán)重肝病癥候群，目前缺乏特效的內(nèi)科治療藥物和手段，治療難度大。在肝衰竭發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，腸源性內(nèi)毒素血癥是重要的促進(jìn)因素之一。內(nèi)毒素血癥可導(dǎo)致肝內(nèi)免疫反應(yīng)過(guò)度激發(fā)，從而加重肝臟損傷[1]。固有免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原生物入侵的第一道防線，內(nèi)毒素可引發(fā)固有免疫系統(tǒng)的激活，促進(jìn)細(xì)胞因子及炎癥遞質(zhì)釋放，激發(fā)炎癥反應(yīng)。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥復(fù)合物是介導(dǎo)人體固有免疫反應(yīng)的重要蛋白,其可被廣泛的外源性和內(nèi)源性刺激物激活,并通過(guò)胱天蛋白酶1(caspase-1)信號(hào)通路調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和IL-18的活化,從而在許多炎癥性疾病的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[2]。為此，本研究通過(guò)觀察犀角散對(duì)肝衰竭小鼠肝內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白及基因表達(dá)的影響，了解其對(duì)肝固有免疫的作用，探討中醫(yī)治療肝衰竭的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡體質(zhì)量18～22 g雄性昆明種小白鼠60只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK(滬)2003-0003。于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心恒溫恒濕動(dòng)物房飼養(yǎng)，12 h明暗交替，自由飲食進(jìn)水。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 犀角散藥物組成：水牛角、茵陳各30 g，黃芩、梔子、升麻各15 g，竹葉9 g，生大黃6 g，上述藥物由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室煎制，制備成水煎劑，生藥含量為1.5 g/ml，保存于4℃冰箱備用。

1.1.3 試劑 皮內(nèi)注射用卡介苗，購(gòu)自上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，批號(hào)：150102；內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購(gòu)自美國(guó)sigma公司，批號(hào)：L-2880；免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；兔抗鼠NLRP3、 IL-1β、caspase-1多克隆抗體購(gòu)自上海博彩生物技術(shù)公司；引物由上海英淮捷基生物科技有限公司合成；NLRP3：上游引物 5’-ATCAACAGGCGAGACCTCTG-3’，下游引物 5’- GTCCTCCTGGCATACCATAGA -3’；caspase-1：上游引物5’- CTTGGAGACATCCTGTCAGGG -3’，下游引物5’- AGTCACAAGACCAGGCATATTCT -3’；IL-1β：上游引物 5’- GAAATGCCACCTTTTGACAGTG -3’，下游引物5’- TGGATGCTCTCATCAGGACAG -3’； Trizol總RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增所需酶及其他試劑均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 60只小鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：犀角散組(A組)、對(duì)照組(B組)、生理鹽水組(C組)以及正常小鼠組(D組)，每組15只。A、B、C 3組于實(shí)驗(yàn)第1天尾靜脈注射卡介苗2.5 mg(0.2 ml)/只，第2天開始A組給予犀角散0.4 ml/d灌胃；B組不用藥；C組給予生理鹽水0.4 ml/d灌胃。第13天尾靜脈注射脂多糖(LPS)10 μg，16 h后處死。D組不進(jìn)行造模，同等條件下常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)13d后，所有小鼠眼眶采血后脫頸處死，并留取肝組織。

1.3 病理學(xué)檢測(cè) 切取大小約1.0mm×1.0mm×1.5mm的肝組織，于10%中性福爾馬林中固定48h，經(jīng)常規(guī)漂洗、脫水、置換、包埋、切片，采用常規(guī)染色觀察肝臟結(jié)構(gòu)變化；EnVision染色后，采用免疫組化圖像軟件分析結(jié)果。計(jì)算陽(yáng)性面積，觀察肝組織內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β的表達(dá)。

1.4 RT-PCR檢測(cè) 勻漿離心肝組織收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：20μl反應(yīng)體系中分別加入樣本RNA 2μg，RT buffer(5×) 4 μl，10 mmol/L dNTPs 1 μl，隨機(jī)引物 1μl，MMLV-RT 1μl，RNAsin 1μl，0.1mol/L DTT 2 μl，混勻，反應(yīng)條件：37 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min。PCR擴(kuò)增：20μl反應(yīng)體系中分別加入cDNA 2μl，Sybr green 10 μl， 上下游引物各 1μl，擴(kuò)增條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)采用 ABI Prism 7300 SDS 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠死亡情況比較 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，注射LPS后16 h內(nèi)，A組有3只，B組有8只，C組有7只小鼠死亡。組間比較死亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 犀角散對(duì)肝衰竭小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響 B、C組小鼠可見肝組織廣泛多發(fā)肝細(xì)胞壞死灶伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而A組小鼠肝臟炎癥程度較輕(見插頁(yè)彩圖1)，提示了犀角散對(duì)肝臟炎癥有一定的抑制作用。

2.3 犀角散對(duì)肝衰竭小鼠肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的影響 見表1。

表1 各組肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果

與D組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05

2.4 犀角散對(duì)肝衰竭小鼠肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1β基因表達(dá)的影響 見表2。

表2 各組肝組織NLRP3、caspase-1、IL-1β基因表達(dá)的檢測(cè)

與D組比較，*P<0.05；與A組比較，#P<0.05

3 討論

肝衰竭病程中機(jī)體內(nèi)劇烈的細(xì)胞免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子以及內(nèi)毒素等是導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死的主要機(jī)制[4]。在肝衰竭病程中，可以出現(xiàn)腸黏膜屏障功能障礙，從而導(dǎo)致內(nèi)毒素吸收增加，同時(shí)由于肝臟功能受損導(dǎo)致內(nèi)毒素滅活減少，兩者共同作用，可使內(nèi)毒素在體內(nèi)蓄積，出現(xiàn)腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素可以激發(fā)體內(nèi)免疫反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷，造成對(duì)肝臟的“雙重打擊”[5]；炎性細(xì)胞因子同時(shí)也是肝再生的重要制約因素，適度的炎癥反應(yīng)在清除病原體的同時(shí)對(duì)肝臟的損傷不大，有利于肝再生，而過(guò)于強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，可使肝細(xì)胞增殖能力減弱或完全喪失，制約肝再生[6]。因此，阻斷內(nèi)毒素激發(fā)的免疫反應(yīng)，對(duì)阻止肝衰竭進(jìn)展具有重要意義。

固有免疫在機(jī)體免疫系統(tǒng)中處于“第一道防線”，可以通過(guò)模式識(shí)別受體識(shí)別并激活病原相關(guān)分子模式，進(jìn)而導(dǎo)致局部組織炎性浸潤(rùn)及炎性因子的釋放，使局部組織持續(xù)呈現(xiàn)炎性損傷[7]，內(nèi)毒素是固有免疫系統(tǒng)激活的重要啟動(dòng)因子之一[8]，因此在肝衰竭病程中，固有免疫也發(fā)揮著重要的作用[9]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLRs)是一重要的介導(dǎo)固有免疫反應(yīng)的模式識(shí)別受體系統(tǒng)，其發(fā)揮作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要有三類，分別為炎癥復(fù)合物通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB 通路以及絲裂原激活蛋白激酶通路[10]。炎癥復(fù)合物是由NLRs家族宿主細(xì)胞在機(jī)體受到病毒和細(xì)菌病原侵襲時(shí)于胞質(zhì)內(nèi)誘導(dǎo)組裝的[11]。炎癥復(fù)合物在接受外界信號(hào)刺激后活化caspase-1，活化的caspase-1可調(diào)控IL-1β等胞內(nèi)重要促炎細(xì)胞因子的成熟、活化，激活固有免疫。目前研究最為清楚的炎癥復(fù)合物是NLRP3炎癥復(fù)合物，它由NLRP3、ASC/PYCARD、caspase-1組成[1]。已有研究表明，HBV核心抗原可以誘導(dǎo)caspase-1活化，提示HBV可能會(huì)引起炎癥復(fù)合物的活化[12]，進(jìn)而導(dǎo)致固有免疫系統(tǒng)的激活。因此炎癥復(fù)合物通路在肝衰竭病程中存在可能作用。

免疫加內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝衰竭小鼠肝臟組織內(nèi)NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白及基因表達(dá)較正常小鼠均有明顯升高，提示肝衰竭小鼠肝組織中存在NLRP3炎癥復(fù)合物通路的激活，可能與固有免疫系統(tǒng)識(shí)別內(nèi)毒素信號(hào)刺激后被激活有關(guān)。

肝衰竭病情進(jìn)展迅速，屬于中醫(yī)“急黃”范疇，即肝瘟病。其基本病機(jī)為濕熱疫毒內(nèi)蘊(yùn)，熏蒸肝膽，肝失疏泄，腸道不利，邪毒壅滯，不能外泄。犀角散以犀角(水牛角)清熱解毒涼血，以黃芩、梔子、升麻、竹葉相配加強(qiáng)清熱解毒，以茵陳清熱利濕退黃，以生大黃通滌胃腸熱毒，共達(dá)清熱涼血、通腑解毒之目的。內(nèi)毒素屬中醫(yī)“毒”的范圍，犀角散組方中大黃、梔子、黃芩等在以往研究中也顯示可抑制腸道大腸桿菌生長(zhǎng)，減少內(nèi)毒素的產(chǎn)生，并阻止內(nèi)毒素在腸道滯留，減少內(nèi)毒素的吸收[13,14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)犀角散處理后，肝衰竭小鼠肝臟炎癥程度減輕，肝組織內(nèi)NLRP3、caspase-1蛋白及基因表達(dá)水平下降，提示犀角散可以通過(guò)影響NLRP3炎癥復(fù)合物通路達(dá)到阻斷減輕肝臟炎癥反應(yīng)的目的，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。