液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定雞蛋中4種硝基呋喃類代謝物殘留

李艷　徐欣然　呂曉峰　侯莉莉　陳夢靜

摘要? [目的]建立一種測定雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。[方法]樣品經(jīng)在酸性條件下水解，加入衍生試劑2-硝基苯甲醛，37? ℃避光孵育16 h，Na2EDTA-McⅡ-vaine緩沖溶液和乙酸乙酯共同提取，經(jīng)固相萃取去除基質(zhì)中的干擾物，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進行檢測。[結(jié)果]4種獸藥殘留采用同位素內(nèi)標法定量，在0.1～20.0 μg/kg線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法回收率為79.85%～102.17%，相對標準偏差（RSD）為1.64%～9.16%，定量限為0.5 μg/kg。[結(jié)論]該方法前處理相對簡單、準確且靈敏度高，適用于雞蛋中4種硝基呋喃類代謝物藥物殘留檢測。

關(guān)鍵詞? 雞蛋;硝基呋喃類代謝物;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;殘留

中圖分類號? S859.84??? 文獻標識碼? A

文章編號? 0517-6611（2019）24-0199-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.24.060

Determination of Four Metabolite Residues of Nitrofuran Antibiotics in Eggs by Liquid Chromatography-tande mmol/Lass Spectrometry

LI Yan1，XU Xin-ran2，Lu Xiao-feng1 et al? （1.Supervision and Testing Center for Agricultural Product Quality of Yancheng City，Yancheng，Jiangsu 224002;2.College of Veterinary，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract? [Objective]The research aimed to establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of nitrofuran metabolite residues in eggs.[Method]The sample was hydrolyzed under acidic conditions，and the derivatizing reagent 2-nitrobenzaldehyde was added.The mixture was incubated at 37? ℃ for 16 h in the dark.The Na2EDTA-McII-vaine buffer solution and ethyl acetate were co-extracted，the interfering substances in the matrix were removed by solid phase extraction and detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.[Result]The residues of the four veterinary drugs were quantified by isotope internal standard method.The linear relationship was good at 0.1-20.0 μg/kg，the correlation coefficient was greater than 0.99，the recovery rate was 79.85%-102.17%，and the relative standard deviation （RSD） was 1.64%-9.16%.The limit of quantification is 0.5 μg/kg.[Conclusion]The method is relatively simple，accurate and sensitive，and is suitable for the detection of four nitrofuran metabolites in eggs.

Key words? Eggs;Nitrofuran metabolites;Liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）;Residue

作者簡介

李艷（1984—），女，江蘇濱海人，畜牧師，碩士，從事農(nóng)畜產(chǎn)品藥物殘留檢測及方法研究。

收稿日期? 2019-06-05

硝基呋喃類藥物主要包含呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因、呋喃西林，因硝基呋喃類原型藥在生物體內(nèi)代謝迅速，故常用檢測代謝物藥物來反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況，其代謝產(chǎn)物分別為AOZ（3-氨基-2-惡唑烷酮）、AMOZ（5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮）、AHD（1-氨基-2-乙內(nèi)酰）、SEM（氨基脲）。它是一類廣譜的抗菌藥物，對常見的革蘭氏陰性菌和陽性菌有抑制作用，常用于預(yù)防或治療禽、豬、牛胃腸道疾病，有時也會作為飼料添加劑使用[1-2]。但是動物大劑量或長期使用硝基呋喃類藥物會引起中毒性反應(yīng)，且由于硝基呋喃類抗生素的代謝物在動物組織中代謝降解慢，并容易在體內(nèi)蓄積，一旦被人類長期食用，甚至可能會引起致癌、致畸、致突變[3-5]。FDA已于2002年禁止了硝基呋喃類在動物性食品中的使用;農(nóng)業(yè)部也于第235號公告將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動物性食品中檢出[6]。所以對硝基呋喃類及其代謝物的藥物殘留檢測顯得非常有必要。目前檢測畜禽肉、水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物已有報道[7-10]，方法主要是膠體金免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[11-14]，但是由于雞蛋中蛋白和脂肪含量非常高且基質(zhì)復(fù)雜，關(guān)于雞蛋中檢測硝基呋喃類代謝物鮮少有報道[15-16]，行業(yè)標準主要是參考動物源性食品檢測標準[17]。因此，建立專門針對雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法顯得很有必要。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 儀器。Agilent 1290 液相色譜儀，Agilent 6460C 三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）;離心機（ST 16R，賽默飛）;旋渦混合器（MS 3BS25，IKA公司）;固相萃取裝置（HHE-12B，天津恒奧）;天平（HCB602H，艾德姆）;真空泵（HPD-25，天津恒奧）;氮吹儀（TTL-DCII，北京同泰聯(lián)）;0.45 μm微孔濾膜（SCAA-104，上海安譜）;固相萃取小柱（200 mg/6cc，Oasis PRIME HLB，Waters）。

1.1.2? 藥品試劑。4種獸藥為呋喃唑酮（AOZ）、呋喃它酮（AMOZ）、呋喃妥因（AHD）、呋喃西林（SEM），對應(yīng)的內(nèi)標標準品分別為AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-[1，2-15N2;13C]，均為德國Dr.公司，標準品純度均不低于99%;甲醇為色譜純（天地），2-硝基苯甲醛、濃鹽酸、甲酸、乙酸銨均為優(yōu)級純，二甲基亞砜、乙酸乙酯、乙二胺四乙酸二納、磷酸氫二鈉、檸檬酸均為國藥分析純。

1.1.3? 標準溶液配制。分別精密稱取適量的4種獸藥AOZ、AMOZ、AHD、SEM標準品，用甲醇分別溶解配制成濃度為1 000 μg/mL的各藥物標準儲備液;準確吸取100 μL的各藥物標準儲備液用甲醇稀釋定容至10 mL，配制成濃度為10 μg/mL的混標儲備液，再準確吸取50 μL的各藥物標準儲備液用甲醇稀釋定容至10? mL，配制成濃度為50 μg/mL的混標工作液;內(nèi)標按同樣步驟配制50 μg/mL的混標內(nèi)標工作液。

1.1.4? Na2EDTA-McⅡ-vaine緩沖溶液配制。準確稱取37.2 g乙二胺四乙酸二納（Na2EDTA·2H2O）、10.9 g磷酸氫二鈉和12.9 g檸檬酸于燒杯內(nèi)，定容至1 000? mL，調(diào)節(jié)pH至4.0，混合均勻，即可。

1.2? 試驗設(shè)計

該試驗通過加標回收驗證檢驗檢測方法，思路為設(shè)3個濃度梯度，從低到高分別為0.5、1.0、2.0 μg/kg，每個濃度設(shè)3個平行樣，另設(shè)空白樣品同時比對。

1.3? 樣品前處理過程

準確稱?。?.00±0.02）g均質(zhì)雞蛋試樣，加入適量內(nèi)標，加入5? mL 0.12 mol/L鹽酸溶液，再加入200 μmL 50? mmol/L 2-硝基苯甲醛的DMSO溶液，渦旋混勻后，37 ℃水浴避光孵育16 h衍生化，冷卻至室溫，加入8? mL Na2EDTA-McⅡ-vaine緩沖溶液，渦旋混勻30 s，再加入8.00 mL乙酸乙酯，渦旋混勻， 8 000 r/min離心5 min，取上層清液備用;Prime固相萃取小柱無需活化，取上清液4.00 mL直接過柱，擠干，濾液于45 ℃下氮吹干，用1 mL甲醇-0.1%甲酸溶液（1∶9，V/V）復(fù)溶，渦旋混勻，過0.45 μm有機系微孔濾膜，供上機待測。

1.4? 標準曲線溶液的配制? 精密量取混合標準工作液濃度為5、10、25、50、100、200 μg/kg各100 μL置6個不同離心管中，再精密量取混合內(nèi)標標準工作液濃度為50 μg/kg各100 μL置上述6個離心管中，按“1.3”前處理過程操作，最終制得標準曲線溶液濃度分別為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/kg，最終內(nèi)標濃度均為5.0 μg/kg。

1.5? 色譜條件

色譜柱：Agilent C18 柱 （Rapid Resolution HD 2.1? mm×100? mm，1.8-Micron）;流 動 相：A相為0.1% （V/V，下同）甲酸水（含5? mmol/L的乙酸銨），B相為0.1% 甲酸甲醇（含5? mmol/L的乙酸銨）;流速0.3 mL/min;進樣量20.0 μL;時間14 min;柱溫30? ℃;梯度洗脫程序見表1。

1.6? 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子（ESI+）;毛細管電壓40 kV;離子源溫度350 ℃;干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力310.26 kPa;采集方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）;增加電壓（+）：100 V。質(zhì)譜采集參數(shù)見表2以及硝基呋喃類代謝物的MRM圖見圖1。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 色譜、質(zhì)譜條件的選擇

流動相采用0.2%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水（含5 mmol/L的乙酸銨）-甲酸甲醇（含5 mmol/L的乙酸銨）2種體系進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.1%甲酸水（含5 mmol/L的乙酸銨）-甲酸甲醇（含5 mmol/L的乙酸銨）對4種目標物響應(yīng)較靈敏，尤其是4種目標物的內(nèi)標物響應(yīng)提高較明顯，可能是流動相體系引入乙酸銨與甲酸形成緩沖體系，這樣流動相體系pH相對恒定，有利于目標物的離子化效果。

該試驗中的4種代謝物以及相對應(yīng)的內(nèi)標物在正離子模式下，采用手動優(yōu)化軟件對4種標準品單標濃度為100 ng/mL 進行二級子離子質(zhì)譜掃描，該研究中的4 種目標化合物以及內(nèi)標物詳細的碰撞能量和定性定量子離子信息見表2。

2.2? 提取、凈化條件的選擇

現(xiàn)有的硝基呋喃類代謝物殘留的前處理幾乎都是用磷酸氫二鉀進行提取的，再采用有機溶劑乙酸乙酯進行液液萃取。該試驗分別進行磷酸氫二鉀、EDTA緩沖鹽提取后結(jié)合乙酸乙酯，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDTA緩沖鹽結(jié)合乙酸乙酯提取結(jié)果響應(yīng)比磷酸氫二鉀結(jié)合乙酸乙酯高?？赡苁且驗橄趸秽惔x和蛋白質(zhì)結(jié)合相當(dāng)穩(wěn)定，酸性條件下可能更有利于結(jié)合態(tài)的藥物提取出來。

因雞蛋樣品含有較多的脂溶性雜質(zhì)，若按肉類樣品方法提取，不進行凈化處理，樣品會很渾濁，如白色奶樣，直接上機不僅會污染儀器，而且基質(zhì)較復(fù)雜，被檢藥物殘留響應(yīng)很低。也有報道在衍生提取前對雞蛋樣品采取有機溶劑洗滌[17]，這樣不僅需要較大量的有機試劑，而且一般的甲醇、乙醇試劑洗滌效果較差，需要采用甲醇、乙醇聯(lián)合乙醚依次洗滌才會有效果，乙醚有特殊的刺激性氣味、極易揮發(fā)，屬于易制毒管制試劑，對操作人員傷害較大。該試驗采用HLB固相萃取小柱凈化，不僅凈化效果好，基質(zhì)干擾小，而且無需進行樣品洗滌。

2.3? 標準曲線和檢出限

從表3可以看出，4種硝基呋喃類代謝物標準曲線在0.1～20.0 μg/kg線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。試驗采用加標回收的方法，以大于3倍的信噪比為檢測限，大于10的信噪比為定量限。計算得出4種硝基呋喃類代謝物各藥物殘留檢出限（LOD）為0.1 μg/kg，定量限（LOQ）為0.5 μg/kg。

2.4? 加標回收試驗

在雞蛋空白基質(zhì)中通過添加0.5、1.0、2.0 μg/kg濃度的4種硝基呋喃類代謝物藥物進行加標回收試驗，每個濃度水平進行3次平行試驗，根據(jù)檢測結(jié)果計算回收率以及RSD。從表4可以看出，4種硝基呋喃類代謝物藥物回收率為79.85%～102.17%，RSD為1.64%～9.16%，均比較滿意，且RSD均小于15%，符合相關(guān)檢測技術(shù)規(guī)范要求。

2.5? 實際樣品檢測? 用該試驗建立的方法對市場隨機采購的20份雞蛋樣品進行篩選測定，尚未檢測出陽性樣品。

3? 結(jié)論

該研究通過對雞蛋樣品前處理條件的充分優(yōu)化改進，建立了雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，樣品經(jīng)EDTA緩沖鹽結(jié)合乙酸乙酯提取、PRIME HLB凈化，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，該方法前處理過程相對簡便、基質(zhì)干擾較小、重復(fù)性好、檢出限低，適用于雞蛋中4種硝基呋喃類代謝物的快速定性篩選和定量檢測分析。

參考文獻

[1]COOPER K M，CADDELL A，ELLIOTT C T，et al.Production and characterisation of polyclonal antibodies to a derivative of 3-amino-2-oxazolidinone，a metabolite of the nitrofuran furazolidone[J].Analytica chimica acta，2004，520（1/2）：79-86.

[2]MCCRACKEN R J，BLANCHFLOWER W J，ROWAN C，et al.Determination of furazolidone in porcine tissue using thermospray liquid chromatography-mass spectrometry and a study of the pharmacokinetics and stability of its residues[J].The analyst，1995，120 （9）：2347-2351.

[3]KAUFMANN A，BUTCHER P，MADEN K，et al.Determination of nitrofuran and? chloramphenicol residues by high resolution mass spectrometry versus tandem quadrupole mass spectrometry[J].Anal Chim Acta，2015，862：41-52.

[4]CHIU S H，SU Y L，LE A V T，et al.Nanocarbon material-supported conducting? poly（melamine） nanoparticle-modified screen-printed carbon electrodes for highly sensitive determination of nitrofuran drugs by adsorptive stripping voltammetry[J].Anal Bioanal Chem，2018，410（25）：6573-6583.

[5]VERDON E，COUEDOR P，SANDERS P.Multi-residue monitoring for the simultaneous determination of five nitrofurans（furazolidone，furaltadone，nitrofurazone，nitrofurantoine，nifursol） in poultry muscle tissue through the detection of their five major metabolites （AOZ，AMOZ，SEM，AHD，DNSAH） by liquid chromatography coupled to electrospray tandem mass? spectrometry in house validation in line with commission decision[J].Analytica chimica acta，2007，586（1/2）：336-347.

[6]農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第235號：動物性食品中獸藥最高殘留限量[A].2020.

[7]桂文龍，蘇治國，徐婷婷.HPLC-MS/MS 檢測豬肉中4 種硝基呋喃類代謝物殘留[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（23）：212-215.

[8]宋興興.LC-MS/MS法檢測雞肉中硝基呋喃類代謝物的殘留[J].食品工業(yè)，2019，40（1）：308-310.

[9]王傳現(xiàn)，黃帆，王敏，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水產(chǎn)品中殘留的硝基呋喃類藥物的代謝物[J].色譜，2013，31（3）：206-210.

[10]邢麗紅，孫偉紅，彭吉星，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定貝類組織中硝基呋喃類代謝物殘留[J].環(huán)境化學(xué)，2019，38（2）：287-296.

[11]趙正苗，羅曉琴，汪善良，等.應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測動物組織中呋喃西林代謝物的殘留[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2012（5）：4-5.

[12]羅杰，李健.呋喃唑酮間接競爭ELISA（ciELISA）檢測法的建立[J].中國海洋大學(xué)學(xué)報，2005，35（2）：213-218.

[13]王媛，蔡友瓊，賈東芬，等.高效液相色譜法檢測水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量[J].分析試驗室，2009，28（12）：86-90.

[14]李丹妮，嚴鳳，張文剛，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測雞肌肉組織中硝基呋喃類代謝物殘留[J].分析測試學(xué)報，2007，26（S1）：218-221.

[15]楊婷婷，易路遙，熊雯，等.QuEChERS-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法測定7種蛋及蛋制品中硝基呋喃代謝物殘留的基質(zhì)效應(yīng)[J].肉類工業(yè)，2018（4）：45-50.

[16]尹暉，孫雷，葉妮，等.雞蛋中硝基呋喃類代謝物殘留的UPLC-MS/MS檢測方法研究[J].中國獸藥雜志，2015，49（12）：42-46.

[17]中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所.農(nóng)業(yè)部 781號公告-4—2006：動物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2016.