超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定強力枇杷露中5種罌粟殼生物堿含量

盧森華 黎強 梁爽 陳宇 龐小蓮 唐明華 李奎

摘要：目的 ?建立強力枇杷露中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因5種罌粟殼生物堿的多指標成分含量測定方法，為提高其質(zhì)量標準提供參考。方法 ?采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。色譜條件：色譜柱為Acquity UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進樣量1.0 μL，流動相為含0.1%甲酸的乙腈溶液-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨水溶液，梯度洗脫;質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI⁺），多反應離子監(jiān)測（MRM）。結(jié)果 ?罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因分別在18.59～185.9 ng/mL（r=0.999 2）、23.26～232.6 ng/mL（r=0.999 1）、11.63～116.3 ng/mL（r=0.999 5）、802.26～8023 ng/mL（r=0.999 5）、149.8～1498 ng/mL（r=0.999 3）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為103.5%、101.4%、99.6%、98.9%、101.3%，RSD分別為1.9%、2.2%、1.6%、3.4%、1.8%。結(jié)論 ?本研究建立的方法操作簡便、結(jié)果準確、重復性好，可為強力枇杷露質(zhì)量標準的提升提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：強力枇杷露;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;罌粟殼生物堿;含量測定

中圖分類號：R284.1 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）12-0062-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.014 ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Simultaneous Determination of Five Alkaloids from Opium Poppy Shell in Qiangli Pipa?Syrup by UPLC-MS/MS

LU Senhua¹， LI Qiang¹， LIANG Shuang²， CHEN Yu¹， PANG Xiaolian¹， TANG Minghua¹， LI Kui³

1. Yulin Center for Food and Drug Control， Yulin 537000， China; 2. Pharmacy School of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China; 3. Pharmacy School of Guilin Medical College， Guilin 541000， China

????Abstract： Objective?To establish a method for determining multi-indicator contents of papaverine， nacotine， tibain， morphine and codeine in Qiangli Pipa?Syrup; To provide referance for?improve the quality standard of the preparation. Methods?UPLC-MS/MS method was used. The chromatographic conditions were Acquity UPLC BEH HILIC （1.7 μm，?2.1 mm × 100 mm）; the column temperature was 40 ℃; the flow?rate was 0.3?mL/min; the injection volume was 1 μL;?the mobile phase was acetonitrile containing 0.1% formic acid?-?10 mmol/L?ammonium phthalate solution containing 0.1% formic acid， with gradient elution. Mass spectrometry conditions： electrospray ionization （ESI⁺） and multi reaction monitoring （MRM）. Results?The papaverine， nacotine， tibain， morphine and codeine had good linear relationship in the range of?18.59–185.9 ng/mL （r=0.999 2）， 23.26–232.6 ng/mL （r=0.999 1）， 11.63–?116.3 ng/mL （r=0.999 5）， 802.26–8023 ng/mL （r=0.999 5）， 149.8–1498 ng/mL （r=0.999 3）， respectively. The average recoveries were 103.5%， 101.4%， 99.6%， 98.9% and 101.3%，?respectively， and the corresponding RSDs were 1.9%， 2.2%， 1.6%， 3.4% and 1.8%， respectively. Conclusion?The method is simple， accurate and reproducible， which can provide references for the improvement of quality standard of Qiangli Pipa?Syrup.

????Keywords：?Qiangli Pipa?Syrup; UPLC-MS/MS; alkaloids from Opium Poppy Shell; content determination

基金項目：廣西高校中青年教師基礎(chǔ)能力提升項目（P18037）;玉林市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（2019年）

通訊作者：陳宇，E-mail：48499917@qq.com

強力枇杷露由枇杷葉、罌粟殼、百部、桔梗、桑白皮和薄荷腦等組成，是《中華人民共和國衛(wèi)生部標準·中藥成方制劑》（第二冊）收載品種，具有鎮(zhèn)咳祛痰、養(yǎng)陰斂肺功效，用于久咳勞嗽、支氣管炎等^[1]。強力枇杷露現(xiàn)行質(zhì)量標準過于簡單，無法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，市售強力枇杷露產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊^[2]。由于該制劑中含有麻醉藥品罌粟殼，若對其用量控制不當，久服易成癮^[3]?，F(xiàn)代化學和藥理研究表明，罌粟殼主要有效成分為生物堿類，包括罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因等，屬于強成癮性成分。為確保制劑的安全性及有效性，必須控制其含量?，F(xiàn)行藥品質(zhì)量標準中僅有生物堿及黃酮的化學反應鑒別，專屬性差，可控性不強，無含量測定項^[1]。目前其含量測定研究僅有HPLC或氣相色譜法測定強力枇杷露中罌粟殼中嗎啡、可待因或罌粟堿含量的報道^[4-9]。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)憑借其高靈敏度、專屬性強、快速高效等優(yōu)點，已逐漸成為中藥成分定量分析的有效手段^[10]。為此，本試驗建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時測定強力枇杷露中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種罌粟殼生物堿含量的方法，以提升強力枇杷露的質(zhì)量控制水平，從而保證產(chǎn)品的安全性。

1 ?儀器與試藥

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-S三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司），3K15高速冷凍離心機（德國Sigma公司），N-EVAP116型氮吹儀（美國Organomation公司），HYQ-3110型渦旋混勻器（美國精騏公司），XS-205Du型電子分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO公司）

鹽酸罌粟堿對照品（批號171214-201205，純度99.9%）、那可丁對照品（批號171224-201304，純度99.9%）、蒂巴因?qū)φ掌罚ㄅ?71216-201304，純度100%）、嗎啡對照品（批號171201-201324，純度99.1%）、磷酸可待因?qū)φ掌罚ㄅ?71203-201306，純度97.5%），中國食品藥品檢定研究院;可待因-D₃內(nèi)標溶液（Cerilliant，批號FE081012-03，1.0 mg/mL）、嗎啡-D₃內(nèi)標溶液（Cerilliant，批號FE102010-04，1.0 mg/mL）;乙腈、甲醇（色譜純，美國Fisher公司），甲酸銨（優(yōu)級純，西亞試劑，批號P22456），甲酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司，批號20170110），QuEChERS AOAC萃取鹽包（美國Agilent公司，部件號5982-6755，含6 g無水MgSO₄、1.5 g NaAc），15 mL QuEChERS AOAC分散固相萃取管（美國Agilent公司，部件號5982-5158，含400 mg PSA，400 mg C₁₈EC，1200 mg無水MgSO₄）。10批強力枇杷露樣品[華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司4批，批號1803031、1803036、1803045、1804013;云南龍發(fā)制藥股份有限公司1批，批號180502;廣西維威制藥有限公司1批，批號181001;江西藥都樟樹制藥有限公司1批，批號160512;哈爾濱康隆藥業(yè)有限公司1批，批號1612259;廣西桂西制藥有限公司1批，批號160825;廣西恒科藥業(yè)有限公司1批，批號170302]均為市售。

2 ?方法與結(jié)果

2.1 ?色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;柱溫為40 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣量為1.0 μL;流動相A為含0.1%甲酸的乙腈、B為含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，按表1條件梯度洗脫。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧離子（ESI）源，正離子模式;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑氣溫度300 ℃;RF透鏡電壓0.5 V;脫溶劑氣流速600 L/h;錐孔氣流速50 L/h;采集模式為多反應離子監(jiān)測（MRM）采集，監(jiān)測離子參數(shù)見表2。5種化合物及內(nèi)標物的提取離子（定量）質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 ?溶液制備

2.2.1 ?對照品溶液及內(nèi)標溶液制備

精密稱取鹽酸罌粟堿對照品13.74 mg（相當于罌粟堿12.41 mg），那可丁對照品11.64 mg、蒂巴因?qū)φ掌?5.50 mg、嗎啡對照品11.57 mg、磷酸可待因?qū)φ掌?4.52 mg（相當于可待因10.24 mg），分別置20 mL量瓶中，加含0.5%甲酸的甲醇溶液適量，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，即得對照品貯備液。

精密量取罌粟堿對照品貯備液30 μL、那可丁對照品貯備液40 μL、蒂巴因?qū)φ掌焚A備液15 μL、嗎啡對照品貯備液1400 μL、可待因?qū)φ掌焚A備液300 μL，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得混合對照品溶液（每1 mL溶液含罌粟堿1.859 μg、那可丁2.326 μg、蒂巴因1.163 μg、嗎啡80.26 μg、可待因14.98 μg）。

精密吸取嗎啡-D₃、可待因-D₃內(nèi)標溶液各1.0 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得混合內(nèi)標溶液（每1 mL溶液含嗎啡-D₃、可待因-D₃各50 μg）。

2.2.2 ?供試品溶液制備

精密量取樣品1.0 mL，置50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加200 μL混合內(nèi)標工作液，加5 mL水，振搖均勻，再精密加入15.0 mL乙腈，渦旋1 min，加入QuEChERS AOAC萃取鹽包（含6 g無水MgSO₄、1.5 g NaAc），迅速振搖后渦旋1 min，10 000 r/min離心5 min，移取10 mL上清液至15 mL QuEChERS AOAC分散固相萃取管中，蓋緊瓶蓋并用力渦旋振搖2 min，8000 r/min離心5 min，取上層清液，過0.22 μm有機微孔濾膜，取濾液待測。

2.2.3 ?陰性對照溶液制備

按處方工藝制備不含罌粟殼的強力枇杷露陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備，得陰性對照溶液。

2.2.4 ?專屬性試驗

分別精密吸取罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因?qū)φ掌啡芤杭肮┰嚻啡芤?、陰性對照溶液，按?.1”項下色譜和質(zhì)譜條件進行測定。在MRM模式下的提取離子流圖可見樣品中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因各峰分離良好，對照品及供試品溶液目標峰的保留時間一致，且陰性對照無干擾。供試品溶液質(zhì)譜圖見圖2。

2.2.5 ?線性關(guān)系考察

分別精密量取混合對照品溶液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置10 mL容量瓶，再加入200 μL混合內(nèi)標溶液，用乙腈定容至刻度，按“2.1”項下色譜和質(zhì)譜條件進行測定。以嗎啡和可待因的色譜峰與相應內(nèi)標物面積的比值為縱坐標，嗎啡和可待因的濃度為橫坐標，繪制標準曲線;以罌粟堿、蒂巴因和那可丁的色譜峰面積為縱坐標，罌粟堿、蒂巴因和那可丁的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，靈敏度較高。嗎啡和可待因采用內(nèi)標法定量，罌粟堿、蒂巴因和那可丁采用外標法定量。5種生物堿線性關(guān)系考察結(jié)果見表3。

2.3 ?方法學考察

2.3.1 ?精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液1.0 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因5種生物堿響應值的RSD分別為1.1%、1.9%、1.2%、1.7%、0.6%。表明儀器精密度良好。

2.3.2 ?重復性試驗

取批號為1803031的樣品6份，每份1.0 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，測定濃度并計算罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因5種生物堿的含量。罌粟堿平均含量為2.007 μg/mL，RSD=2.7%;那可丁平均含量為3.558 μg/mL，RSD=2.3%;蒂巴因平均含量為1.383 μg/mL，RSD=1.3%;嗎啡平均含量為59.79 μg/mL，RSD=2.1%;可待因平均含量為12.35 μg/mL，RSD=0.2%。表明該方法重復性良好。

2.3.3 ?穩(wěn)定性試驗

取上述供試品溶液，分別于0、1、2、4、6、12 h進樣1.0 μL，測定其濃度并計算罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿的含量。罌粟堿平均含量為2.121 μg/mL，RSD=1.1%;那可丁平均含量為3.677 μg/mL，RSD=0.7%;蒂巴因平均含量為1.490 μg/mL，RSD=2.3%;嗎啡平均含量為60.01 μg/mL，RSD=1.8%;可待因平均含量為12.14 μg/mL，RSD=1.0%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 ?加樣回收率試驗

精密量取已知含量（每1 mL含罌粟堿2.007 μg、那可丁3.558 μg、蒂巴因1.383 μg、嗎啡59.79 μg、可待因12.35 μg）的強力枇杷露樣品6份，每份0.5 mL，精密稱定，分別依次精密加入混合對照品溶液（每1 mL溶液中含罌粟堿1.859 μg、那可丁2.326 μg、蒂巴因1.163 μg、嗎啡80.26 μg、可待因14.98 μg）400、400、500、500、600、600 μL，按“2.2.2”項下方法制備，分別進樣1.0 μL，測定罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因的含量并計算回收率，結(jié)果見表4。

2.4 ?樣品含量測定

取10批次強力枇杷露樣品，每份1.0 mL，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣1.0 μL，測定其響應值并計算罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡和可待因的含量，結(jié)果見表5。

3 ?討論

參考相關(guān)文獻^[11-12]，本試驗樣品處理方法主要考察了傳統(tǒng)的溶劑提取法、基質(zhì)分散固相萃取法（QuEChERS法）、通過型固相萃取法（新型PRiME HLB小柱）進行凈化，傳統(tǒng)提取方式不能滿足快速、高通量檢測的要求，用QuEChERS法和PRiME HLB固相萃取小柱進行凈化效果基本相同，而QuEChERS法操作更為簡單，故選擇QuEChERS法為樣品處理方法。

在色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，嗎啡等生物堿在BEH C18柱上基本不保留，無法分離，因此選擇BEH HILIC正相色譜柱，該法重現(xiàn)性好，保留時間穩(wěn)定，能達到有效分離。此外，本試驗還考察了流動相因素（乙腈/含0.1%甲酸的乙腈-0.1%甲酸溶液/含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液不同比例梯度洗脫）、進樣量因素（1、5 ?L）對供試品溶液分離效果的影響，最終確定流動相為含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液，進樣量為1 ?L。

罌粟殼屬嚴格管控的麻醉藥品，含罌粟殼藥品必須對罌粟殼含量進行有效的控制。罌粟殼中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿為其主要功效成分，其含量過低則無法達到鎮(zhèn)咳效果，而含量過高則較易引發(fā)成癮性，故應有效控制其含量，使其在發(fā)揮藥效的同時減少毒副作用。參照2015年版《中華人民共和國藥典》（一部）規(guī)定罌粟殼中嗎啡含量限度為0.06%～0.40%^[13]。強力枇杷露處方中罌粟殼投料為50 g，制成1000 mL，嗎啡含量的限度范圍按藥材上限100%轉(zhuǎn)移率計算為30.0～200.0 μg/mL。本試驗10批強力枇杷露樣品的嗎啡含量為35.77～85.11 μg/mL，以該指標可判定10批樣品均為合格藥品。但不同企業(yè)樣品的其他指標成分含量差異較大，罌粟堿為0.755～4.516 μg/mL、那可丁為0～3.558 μg/mL、蒂巴因為0.558～4.283 μg/mL、可待因為7.867～27.35 μg/mL。因此，提高強力枇杷露的質(zhì)量標準意義重大，本研究可為強力枇杷露含量限度的確定提供數(shù)據(jù)參考。

UPLC-MS/MS在不影響分離效果的情況下大大提高了樣品中各成分的分析速度，而且提高了該物質(zhì)的檢測限。本研究建立了強力枇杷露中的多指標成分UPLC-MS/MS含量測定方法，在5 min內(nèi)即可同時準確測定強力枇杷露中罌粟堿、那可丁、蒂巴因、嗎啡、可待因5種生物堿的含量，為強力枇杷露的質(zhì)量控制提供了一種快速、靈敏、穩(wěn)定、可靠的方法。

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（收稿日期：2019-03-08）

（修回日期：2019-03-26;編輯：陳靜）