多糖結(jié)構(gòu)分析的研究進(jìn)展

霍琛鑫，劉忠義，嚴(yán)開川，梁啟超

(牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011)

多糖作為植物中重要的活性成分，具有較多活性作用，如抗腫瘤[1]、降血糖[2]、抗病毒[3]、抗氧化[4]以及提高免疫力等，要想更加深入的研究多糖的活性作用，就要對多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。結(jié)構(gòu)是多糖活性的基礎(chǔ)，多糖是由單糖脫水縮合而成，單糖種類眾多，且單糖之間連接方式也不盡相同，因此，對多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析的難度也進(jìn)一步增大。

1 多糖的單糖組成

研究多糖結(jié)構(gòu)首先要研究多糖的單糖組成。單糖種類眾多，常見的單糖有多種，如葡萄糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖以及甘露糖等[5]，因此由各單糖組成的多糖也種類繁多，而單糖組成分析也就成了多糖結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。通常用水解法通過完全水解將多糖鏈分解成單糖，水解后要經(jīng)過中和、過濾、衍生化等處理，氣相色譜法、薄層層析法、毛細(xì)管電泳法[6]以及高效液相色譜法[7]等是對多糖的單糖組成進(jìn)行檢測的較為常見的幾種方法。最為常用的方法有氣相色譜法和高效液相色譜法，兩種方法能夠較為確切的測出各單糖組分以及其摩爾比。HPLC用于單糖組成分析，自20世紀(jì)70年代開始便有研究，此法分離速度快，分辨率也較高，重現(xiàn)性也非常好，已經(jīng)成為最為常用的分析方法[8]。唐華麗[9]等在對枸杞多糖的研究中，使用高效液相色譜法對十種單糖標(biāo)準(zhǔn)品和枸杞多糖亞組分LBP3樣品進(jìn)行分析，然后根據(jù)LBP3樣品中所出的峰及其出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜峰及出峰時(shí)間進(jìn)行逐一比對，經(jīng)分析得出結(jié)論，認(rèn)為此亞組分由D-甘露糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-半乳糖胺共同組成(其摩爾比是5.52:28.06:5.11: 1.70: 1)。薄層色譜法應(yīng)用也較為廣泛，可快速的鑒別出單糖的組成。肖作奇[10]等從矮地茶中提取得到多糖AJP，采用薄層色譜法和高效液相色譜法兩種方法對矮地茶多糖進(jìn)行分析，結(jié)果皆表明矮地茶多糖由葡萄糖和半乳糖組成，且高效液相色譜法結(jié)果表明其摩爾比值約為1: 2.36。

2 化學(xué)分析方法

2.1 高碘酸氧化和Smith降解多糖分子中的連二羥基或連三羥基可被高碘酸選擇性的氧化斷裂，相應(yīng)生成多糖醛、甲酸，連二羥基的碳-碳鍵被氧化斷裂生成醛，而連三羥基的碳-碳鍵被氧化斷裂后生成醛和一分子甲酸，根據(jù)高碘酸的消耗量及甲酸的生成量，可判斷多糖分子中糖苷鍵的位置和連接方式等結(jié)構(gòu)信息[11]，所以高碘酸氧化反應(yīng)常被用于多糖結(jié)構(gòu)的研究。焦中高[12]在研究紅棗多糖結(jié)構(gòu)時(shí)，對其各級組分進(jìn)行了高碘酸氧化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)紅棗多糖各級組分中均有甲酸產(chǎn)生，而且高碘酸的使用量與甲酸的產(chǎn)生量之比均大于3:1，因此認(rèn)為其各級組分的主鏈均主要以1→4糖苷鍵連接，且存在1→6糖苷鍵，但支鏈的連接鍵型及分枝程度等有一些差異。在多糖結(jié)構(gòu)的研究過程中，高碘酸氧化一般結(jié)合Smith降解法，Smith降解是將高碘酸氧化產(chǎn)物還原后進(jìn)行水解，由水解產(chǎn)物可以推斷出糖苷鍵的鍵型及其位置等信息[13]，以便進(jìn)一步推測多糖分子結(jié)構(gòu)。經(jīng) Smith降解后有甘油產(chǎn)生，則提示有1→6、1→2結(jié)合的糖苷鍵，但1→2位結(jié)合的無甲酸生成；若檢測出丁四醇，則提示存在1→4 結(jié)合的糖苷鍵；若能檢出單糖，如葡萄糖、半乳糖等，則提示有1→3結(jié)合的糖苷鍵[14]。李海雪[15]就是首先利用高碘酸氧化，推測桑椹多糖MFPA-1不存在1→6糖苷鍵，隨后對其氧化反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行Smith降解經(jīng)氣相色譜分析，推測MFPA-1中葡萄糖、甘露糖和鼠李糖主要以1→2糖苷鍵連接，阿拉伯糖和半乳糖主要以1→3糖苷鍵連接。

在早期，高碘酸氧化和Smith降解的應(yīng)用較為常見，但是這兩種方法需要依據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行推斷，較為容易產(chǎn)生誤差，且實(shí)驗(yàn)過程所需時(shí)間較長，以及實(shí)驗(yàn)規(guī)范性也對結(jié)果準(zhǔn)確度有較大的影響，再加上現(xiàn)在許多實(shí)驗(yàn)室所配備的設(shè)備較為先進(jìn)，所以近些年多糖結(jié)構(gòu)解析研究中利用高碘酸氧化和Smith降解方法日漸減少。

2.2 甲基化分析甲基化分析是多糖結(jié)構(gòu)分析最為經(jīng)典和重要的方法之一，此法是通過甲基化試劑把多糖中各單糖殘基上的游離羥基全部甲基化，再經(jīng)過還原和乙?；磻?yīng)得到它們的衍生物，然后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜檢測分析，從而判斷出各單糖的連接方式。同時(shí)，根據(jù)各單糖殘基在產(chǎn)物中所占的比例，可以推測得到此連接方式的單糖在多糖中的分子比例[16]。孫永敢[17]等人以黑木耳為原料提取得到黑木耳多糖，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，其甲基化結(jié)果表明黑木耳多糖的兩個(gè)組分AAP3-20和AAP3-60分別含有不同的殘基，AAP3-20有1，4，6-Glcp、1，3，6-Glcp、1，6-Glcp、t-Glcp這幾種殘基，AAP3-60則含t-Glcp、1，3-Xylp、1，4，6-Manp、1，4-Manp、1，6-Glcp。甲基化分析是判定多糖分子糖苷鍵連接方式的較為常用的方法，可將甲基化結(jié)果分析與其他方法的結(jié)果進(jìn)行互相對比驗(yàn)證，從而使結(jié)果更加準(zhǔn)確。高云霄[18]等人在對鐵皮石斛多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析時(shí)，甲基化分析結(jié)果表明鐵皮石斛多糖中只有吡喃糖的信號，其主要的葡萄糖和甘露糖均為吡喃糖。

3 儀器分析方法

3.1 紅外光譜法隨著儀器分析技術(shù)迅速發(fā)展，在多糖結(jié)構(gòu)研究中儀器的應(yīng)用也越來越普遍，且使用儀器進(jìn)行分析靈敏度比較高，操作較為簡單，準(zhǔn)確度很高，成為多糖結(jié)構(gòu)分析過程中最常用的方法之一。多糖結(jié)構(gòu)的分析過程中離不開波譜，紅外光譜法是解析多糖結(jié)構(gòu)的一種重要手段。糖類結(jié)構(gòu)中的一些特殊功能基團(tuán)都呈現(xiàn)一些特異的紅外吸收光譜，使用波數(shù)為4000cm-1～400cm-1的紅外通過檢測樣品，對各段波數(shù)下透過樣品光的強(qiáng)度進(jìn)行測量，以波數(shù)為橫坐標(biāo)，以光的透射率為縱坐標(biāo)，儀器記錄下來的曲線即為紅外光譜[19]。紅外光譜在多糖結(jié)構(gòu)解析上主要是識別多糖的官能團(tuán)以及各類吡喃糖糖苷鍵構(gòu)型[20]。伍芳芳[21]參照溴化鉀壓片法對猴頭菇多糖HEP-W進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜測定，圖譜顯示，3335cm-1處出現(xiàn)較寬的強(qiáng)吸收峰，2921cm-1以及1643 cm-1處出現(xiàn)弱吸收峰，這常用于判斷該檢測品是否為多糖。此外，在1405 cm-1與1066 cm-1的吸收峰分別歸屬為糖鏈上的C=C伸縮振動(dòng)和吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)。913 cm-1的特征吸收峰歸屬為β-D-吡喃葡萄糖，而571 cm-1左右的吸收峰表明結(jié)構(gòu)含有α-構(gòu)型。由紅外分析結(jié)果可以看出HEP-W同時(shí)具有α-型以及β-型糖苷鍵連接方式。

3.2 核磁共振波譜法核磁共振技術(shù)是又一重要的波譜分析方法，即使在沒有結(jié)構(gòu)背景知識的情況下，它也可以獲得多糖最完全的結(jié)構(gòu)信息，成為解決多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜問題的最常用工具。此技術(shù)是20世紀(jì)中期發(fā)展起來的一種技術(shù)，該法最大的好處是不破壞多糖樣品，因而能準(zhǔn)確反映出多糖的真實(shí)結(jié)構(gòu)，且能對多糖進(jìn)行回收，因此是最為常用的多糖結(jié)構(gòu)解析的方式。一般而言，1H- NMR 和13C- NMR 譜可得到糖類樣品的整體結(jié)構(gòu)信息，二維NMR譜(如COSY、HMQC、HMBC等)則能夠得出相關(guān)碳?xì)溥B接方式等信息[23]。顧菲菲[24]等從赤芝中提取和分離純化獲得靈芝多糖組分LZJ-0.15，并通過核磁共振波譜法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，1H-NMR和13C-NMR 譜圖中異頭氫的化學(xué)位移分別為δ4.4和δ4.7，異頭碳的化學(xué)位移為δ102.5，從而推斷LZJ-0.15主要由β糖苷鍵連接的吡喃型葡萄糖構(gòu)成，結(jié)合二維譜圖，推斷 LZJ-0.15 主要為 β-(1→3) 和 β-(1→6) 連接的葡聚糖。自從核磁共振波譜技術(shù)應(yīng)用到多糖研究中來，多糖結(jié)構(gòu)分析發(fā)展迅速，相信在不久的將來，可以研究出由自動(dòng)化分析代替人工分析的儀器，使多糖的結(jié)構(gòu)分析更為簡便，從而促進(jìn)多糖研究的發(fā)展。

除上述方法外，電子顯微鏡法，X-射線衍射、拉曼光譜分析[25]以及酶學(xué)和免疫學(xué)方法[26]等分析方法在多糖結(jié)構(gòu)研究中亦有廣泛的應(yīng)用。隨著科學(xué)和技術(shù)的發(fā)展，多糖的結(jié)構(gòu)研究會(huì)日趨簡單、高效準(zhǔn)確。