UPLC-MS/MS 法測定膠基型嚼煙中13 種甜味劑

付 強，李國政，林奕云，楊 繼，蔡群娣，張東豫，邱建華*

1. 廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣州市越秀區(qū)先烈中路100 號34 棟504 510070

2. 河南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，鄭州經(jīng)開區(qū)第三大街8 號 450000

3. 云南中煙工業(yè)有限責任公司技術(shù)中心，昆明市五華區(qū)紅錦路367 號 650031

無煙氣煙草制品(Smokeless tobacco products,STPs)是指不經(jīng)燃燒、直接通過口腔或鼻腔吸食的煙草制品［1］。與傳統(tǒng)卷煙相比，無煙氣煙草因為具有危害性較小、不產(chǎn)生二手煙、不受場所限制等優(yōu)點而得到廣泛關(guān)注［2］。其中，膠基型無煙氣煙草制品最早是由瑞典火柴公司首先研發(fā)成功并試投放市場［3］，是一種以煙草或煙草提取物為有效組分，以可食用膠基為載體，添加了香精香料、軟化劑、甜味劑等食品添加劑，通過咀嚼方式向人體遞送煙堿的新型煙草制品［4］。近年來，隨著全球控煙趨勢的加劇及消費者對健康的日益關(guān)注，新型煙草制品相關(guān)研究已成為煙草行業(yè)重要的研究方向之一，膠基型嚼煙分析檢測方面的研究目前主要集中在煙堿等成分的分析方面。楊繼等［5］用GC-MS 法測定了膠基型嚼煙中煙堿的質(zhì)量分數(shù)；張杰等［6］測定了國外口含型無煙氣煙草制品總煙堿、游離煙堿和煙草特有亞硝胺的質(zhì)量分數(shù)；張文娟等［7］研究了膠基型無煙氣煙草制品中煙堿的釋放行為。

甜味劑是一種重要的食品添加劑，按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑［8］，膠基型嚼煙的甜味通常是由添加的甜味劑帶來的。與常見的糖類物質(zhì)相比，甜味劑因具有甜度高、熱量低、不易引起齲齒等特點，特別適合在膠基型嚼煙中使用。但是，由于各種天然或合成甜味劑往往帶有一定的風味特征或異味，在膠基型嚼煙中添加時，考慮到膠基型嚼煙的風格特征，甜味劑品種和添加量的選擇顯得尤為重要。美國食品與藥品管理局（FDA）對于甜味劑添加限量要求為“適量”添加。我國國家標準對各種食品中甜味劑的添加量進行了明確限定［9］。隨著新型煙草制品的研究和開發(fā)，急需建立膠基型嚼煙中甜味劑的相關(guān)檢測指標及方法，為膠基型嚼煙中甜味劑的安全使用提供技術(shù)依據(jù)。

目前，甜味劑的測定方法主要有離子色譜法［10］、毛細管電泳法［11］、HPLC 法［12-13］、LC-MS 法［14-16］等。由于LC-MS/MS 法的前處理相對簡單、選擇性強、靈敏度高以及抗基質(zhì)干擾能力強，目前已應(yīng)用于食品添加劑的測定［17-19］。但是目前各種方法測定的主要是7 種人工合成甜味劑，尚未見同時測定13 種天然和合成甜味劑的方法報道。本研究中采用UPLC-MS/MS 法對膠基型嚼煙中13 種天然甜味劑和合成甜味劑進行分析研究，旨在為膠基型嚼煙甜味劑的檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

膠基型嚼煙由云南中煙工業(yè)有限責任公司提供，樣品先用粉碎機粉碎，選擇粒徑＜5 mm的樣品顆粒進行下一步測定。

甲醇、乙腈（色譜純，美國Honeywell 公司）；甲酸（99%）、乙酸（99.8%）（上海晶純試劑公司）；正己烷（AR，廣州化學試劑廠）；甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜、三氯蔗糖、阿斯巴甜、山梨糖醇（≥97%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司）；紐甜（99.0%，加拿大TRC 公司）；甜菊糖苷、甘露糖醇、木糖醇（≥98.5%，中國藥品生物制品檢定所）；麥芽糖醇（≥99%，美國Sigma-Aldrich公司）；赤蘚糖醇、異麥芽酮糖醇［≥99%，美國藥典標準品(USP)］；水為自制超純水。

1290 超高效液相色譜儀、6460A 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent 公司）；CF16RXII 冷凍離心機（日本Hitachi 公司）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；BT125D 電子天平（感量0.000 01 g, 德國Sartorius 公司）；Oasis HLB 固相萃取柱（美國Waters公司）。

1.2 方法

1.2.1 甜味劑標準儲備液的配制

分別稱取13種天然和合成甜味劑的標準品，用超純水配制成濃度均為1.0 mg/mL的標準儲備液。分別取木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、赤蘚糖醇、麥芽糖醇、異麥芽酮糖醇儲備液，用超純水稀釋配制成濃度均為10 μg/mL的天然甜味劑混合儲備液。分別取安塞蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、紐甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷儲備液，用超純水稀釋配制成10 μg/mL 的合成甜味劑混合儲備液。所有儲備液于4 ℃冷藏保存。

取天然甜味劑和合成甜味劑的混合儲備液，用超純水稀釋，配制成濃度分別為10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1 000.0 μg/L 的混合標準工作溶液。

1.2.2 樣品前處理與分析

準確稱取1.0 g 膠基型嚼煙樣品于50 mL離心管中；加入5 mL 正己烷，渦旋混勻并超聲處理10 min；然后加入10 mL 超純水，振蕩提取10 min，渦旋混勻1 min；于3 000 r/min 離心，轉(zhuǎn)移中間水相部分于25 mL容量瓶中。離心管中繼續(xù)加入10 mL 超純水重復提取一次，取水相與上一次提取液合并，用超純水定容。移取1.00 mL提取液于10 mL具塞試管中，加入2 mL正己烷，渦旋混合1 min，靜置分層，吸取下層水相過0.22 μm 濾膜，進行UPLC-MS/MS 分析。分析條件：

（1）合成甜味劑。色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(4.6 mm×50 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相：甲醇（A），水（B）；流速：0.4 mL/min；梯度程序：0～2.5 min 20%～90% A，2.5～3.5 min 90%A，3.5～5.0 min 20%A。

（2）天然甜味劑。色譜柱：GRACE Prevail Carbohydrate ES 柱（4.6 mm×250 mm, 5 μm）；柱溫：45 ℃；進樣量：10 μL；流動相：乙腈（A），水（B）；流速：0.4 mL/min；梯度程序：0～5 min 10%B，5～16 min 10%～40%B，16～19 min 40%～75%B，19～20 min 10%B。

質(zhì)譜離子源：帶鞘流氣的AJS ESI 源；檢測模式：負離子模式；檢測方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：5.0 mL/min；噴霧氣壓力：0.31 MPa；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流量：11 L/min；毛細管電壓：-3 500 V；噴嘴電壓：-500 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 甜味劑質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別使用濃度為10.0 μg/mL 的天然甜味劑和合成甜味劑混合溶液，通過直接進樣的方式在三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀上對離子源參數(shù)、母離子與多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式二級碎片離子的質(zhì)荷比、碎裂電壓（Fragmentor）、碰撞能（CE）等參數(shù)進行優(yōu)化，各種甜味劑的離子信息見表1。本實驗中的天然甜味劑和合成甜味劑大多帶有羧基或羥基官能團，在電噴霧質(zhì)譜的負離子模式下可以獲得較好的檢測靈敏度。

表1 7 種合成甜味劑和6 種天然甜味劑的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)Tab.1 MRM parameters of 7 synthetic sweeteners and 6 natural sweeteners

2.2 液相色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

實驗中對比了各種不同的色譜柱對合成甜味劑和天然甜味劑的分離效果，合成甜味劑與天然糖醇類甜味劑因分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異較大，只能在不同色譜柱上分別進行分離。分別選用反相色譜柱和糖柱分離合成甜味劑和天然糖醇類甜味劑。

7 種合成甜味劑的分子結(jié)構(gòu)大都具有芳環(huán)或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，且分子結(jié)構(gòu)有明顯差異，可以在反相液相色譜柱上實現(xiàn)分離。實驗對比了Agilent SB-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent SB-C18（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent Eclipse Plus C18ARHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）4 種色譜柱對合成甜味劑的保留和分離能力，結(jié)果見表2。綜合考慮選用Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6 mm×50 mm, 2.7 μm）柱作為7 種合成甜味劑的分析柱。

天然糖醇類化合物中含有較多的羥基等親水結(jié)構(gòu)，在常見反相色譜柱和親水作用色譜（HILIC）柱上均無法進行正常分離。實驗對比了兩種專用的糖柱Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250 mm, 5 μm）和GRACE Prevail Carbohydrate ES（4.6 mm×250 mm,5 μm）對6 種天然糖醇類甜味劑的色譜分離性能。在Shodex Asahipak NH2P-50 4E 柱上，山梨糖醇+甘露糖醇和麥芽糖醇+異麥芽酮糖醇這兩對同分異構(gòu)體無法實現(xiàn)分離，而GRACE Prevail Carbohydrate ES在乙腈-水流動相體系中可以較好地分離6 種天然糖醇類化合物。 因此選用GRACE Prevail Carbohydrate ES 柱作為天然甜味劑的分離柱。6 種天然甜味劑在不同色譜柱上的分離效果見圖1。

表2 4 種反相色譜柱對7 種合成甜味劑的分離效果Tab.2 Separation of 7 synthetic sweeteners by 4 reversed-phase columns

2.2.2 流動相的選擇

分別考察了乙腈-水體系和甲醇-水體系作為流動相在Poroshell 120 EC-C18色譜柱上對合成甜味劑的分離效果，分離合成甜味劑的總離子流色譜圖和MRM色譜圖見圖2。結(jié)果表明，甲醇-水作為流動相對合成甜味劑的分離度更高，這可以解釋為甲醇在反相體系中相對于乙腈具有較弱的洗脫能力，具有一定極性的合成甜味劑在甲醇體系中的保留時間更長，從而表現(xiàn)出更明顯的差異性。7 種合成甜味劑的出峰時間在1.5～3.0 min 之間，從總離子流色譜圖上看，幾種合成甜味劑不能實現(xiàn)完全分離，其中糖精鈉和安賽蜜的保留時間重合，阿斯巴甜和三氯蔗糖的保留時間接近。但因為這兩種化合物的質(zhì)荷比相差很大，在質(zhì)譜MRM 檢測模式下基本不存在干擾，保留時間的重合不影響同時測定。

圖1 6 種天然甜味劑在不同糖柱上的分離效果Fig.1 Separation of 6 natural sweeteners by different sugar columns

圖2 合成甜味劑和天然甜味劑的總離子流色譜圖和多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig.2 TIC and MRM chromatograms of synthetic sweeteners and natural sweeteners

另外優(yōu)化了GRACE Prevail Carbohydrate ES（4.6 mm×250 mm, 5 μm）糖柱在乙腈-水流動相體系下對6種天然糖醇類甜味劑的梯度洗脫條件。天然糖醇的總離子流色譜圖和MRM色譜圖見圖2。在6種天然糖醇類物質(zhì)中，山梨糖醇和甘露糖醇互為同分異構(gòu)體，麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇互為同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)非常接近且MRM檢測參數(shù)也幾乎一致，無法通過串聯(lián)質(zhì)譜相互區(qū)分，因此對色譜分離提出了較高的要求。在經(jīng)過優(yōu)化的梯度淋洗條件下，6種糖醇類物質(zhì)的分離效果較為滿意，山梨糖醇和甘露糖醇接近實現(xiàn)基線分離，麥芽糖醇和異麥芽酮糖醇完全達到基線分離。

2.3 前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 樣品提取條件的優(yōu)化

本實驗中涉及的合成甜味劑和天然甜味劑均易溶于水。測定常規(guī)食品中的甜味劑可用水相進行提取；但膠基型嚼煙中的基礎(chǔ)物質(zhì)是膠基，其主要成分是天然樹膠、聚醋酸乙烯樹脂和丁苯橡膠，還含有橡膠軟化劑、增塑劑、乳化劑、填充料等。由于膠基的存在，樣品難以被粉碎成細小顆粒且不溶于水，無法直接用水相提取。根據(jù)膠基的性質(zhì)，可以先將樣品粉碎成較大的顆粒，然后用有機溶劑溶解、溶脹其中的膠基，再用水相提取。對比了正己烷、四氫呋喃、二氯甲烷對樣品中膠基的溶解效果，結(jié)果表明，3 種有機溶劑均可快速溶解樣品顆粒中的膠基形成懸濁液。綜合考慮環(huán)境影響和試劑成本，最終選擇毒性較小、價格較低的正己烷作為預處理溶劑。

將膠基嚼煙樣品用正己烷進行預處理后，可用近似液液萃取的方式對其中的水溶性物質(zhì)進行提取。對比了使用純水、甲醇-水（1∶1）、乙腈-水（1∶1）作為提取溶劑對空白加標樣品中甜味劑的提取效果。圖3 中的結(jié)果表明用純水作為提取劑的提取率高于甲醇/水和乙腈/水，其中原因可能是甲醇/水和乙腈/水體系中溶解了較多的脂溶性成分，在質(zhì)譜鑒定環(huán)節(jié)影響了被測物質(zhì)甜味劑的離子化效率。根據(jù)以上結(jié)果，采用純水作為甜味劑的提取溶劑。

圖3 提取溶劑對甜味劑提取效率的影響Fig.3 Effects of extraction solvents on extraction efficiencies of sweeteners

2.3.2 凈化條件的優(yōu)化

膠基型嚼煙類樣品中所含的磷脂等脂溶性成分可能在質(zhì)譜檢測時干擾甜味劑的離子化過程，因此有必要對提取液進行凈化。實驗中對比了不凈化直接測定、HLB 柱固相萃取凈化［9］和正己烷液-液萃取快速凈化對加標樣品測定結(jié)果的影響，結(jié)果見圖4?？梢?，經(jīng)過Waters Oasis HLB 固相萃取柱凈化和正己烷快速凈化后的樣品提取液，除安賽蜜外的其他甜味劑的響應(yīng)值均高于未經(jīng)凈化的樣品提取液。正己烷凈化與固相萃取凈化效果相近，且成本低、操作簡便，故選擇正己烷液-液萃取快速凈化方法進行樣品提取液的凈化。

2.4 線性范圍和檢測限

按1.2.1 節(jié)配制的標準溶液在LC-MS/MS儀上進行分離檢測，利用基質(zhì)加標的方式得出實驗的檢測結(jié)果，然后分別以甜味劑的濃度為橫坐標、色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線并進行線性回歸。分別按S/N=3 和S/N=10 計算檢出限和定量限。各甜味劑的線性方程和相關(guān)參數(shù)見表3。結(jié)果表明，在實驗濃度范圍內(nèi)，13 種甜味劑線性回歸方程的R2在0.990 7～0.999 6 之間，說明13 種甜味劑標準曲線的線性相關(guān)性良好。

圖4 凈化條件對13 種甜味劑檢測的影響Fig.4 Effects of clean-up conditions on recoveries of 13 sweeteners

表3 13 種甜味劑的線性回歸方程、R2、線性范圍、檢出限和定量限Tab.3 Linear regression equations, R2, linear ranges, limits of detection, limits of quantitation of 13 sweeteners

經(jīng)過條件優(yōu)化下，13 種甜味劑的方法檢出限分別在6.8×10-6～0.30 μg/kg之間，定量限分別在2.3×10-5～1.0 μg/kg 之間，優(yōu)于現(xiàn)行國標方法［9］，各甜味劑的線性范圍為0.001～1.0 μg/mL，可以滿足膠基型嚼煙的檢測需求。

2.5 準確性和重現(xiàn)性

經(jīng)過條件優(yōu)化，測定5、50、500 μg/kg 3 個添加水平的膠基型嚼煙樣品中的各種甜味劑，計算各物質(zhì)的回收率，結(jié)果見表4?？芍?種添加水平下，13種甜味劑的加標回收率分別在80.2%～95.0%、84.8%～97.6%、83.1%～95.1%之間，說明本檢測方法的準確性較高。

為考察方法的精密度，進行了加標樣品的日內(nèi)和日間重復測定，對各樣品分別進行6 次平行測定，根據(jù)測定結(jié)果分別計算各甜味劑的相對標準偏差（RSD）。結(jié)果顯示，日內(nèi)、日間RSD范圍分別為1.35%～5.56%，3.13%～7.00%，均小于10%，說明本方法重現(xiàn)性較好。

2.6 實際樣品測定結(jié)果

按優(yōu)化分析方法測定了10 種膠基型嚼煙樣品中各種甜味劑的質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表5?？芍?，10 種膠基型嚼煙樣品中均檢出了甜味劑，主要有木糖醇、麥芽糖醇、山梨糖醇、紐甜、糖精鈉、安賽蜜。各樣品中普遍檢出3 種以上甜味劑。其中天然甜味劑的檢出現(xiàn)象較為普遍，除甘露糖醇、赤蘚糖醇外的其他天然糖醇均有檢出，其質(zhì)量分數(shù)在0.9～857 mg/kg范圍內(nèi)。合成甜味劑中三氯蔗糖的檢出率相對較高，其質(zhì)量分數(shù)在0.18～1.05 mg/kg 之間。結(jié)合嚼煙口味分析可知，具有植物提取物風味的嚼煙中主要添加的是山梨糖醇和麥芽糖醇，而調(diào)配的嚼煙中主要是木糖醇和麥芽糖醇?？傮w而言，檢出甜味劑的情況與標簽基本相符，且并未超過食品安全國家標準［9］對食品相關(guān)甜味劑允許使用量的限值，說明樣品中甜味劑的添加情況處于安全范圍。

表4 LC-MS/MS 法測定膠基型嚼煙中甜味劑的加標回收率和精密度Tab.4 Spiked recoveries, intra-and inter-day RSDs of sweeteners

表5 膠基型嚼煙樣品中甜味劑質(zhì)量分數(shù)的測定結(jié)果Tab.5 Contents of synthetic sweeteners and natural sweeteners in gum-based chewing tobacco samples （mg·kg-1）

3 結(jié)論

①優(yōu)化并建立了測定膠基型嚼煙中7 種合成甜味劑和6 種天然糖醇類甜味劑的UPLC-MS/MS 法：改進了樣品的前處理，既降低了基質(zhì)干擾，又減少了時間和溶劑消耗；優(yōu)化了反相柱和專用糖柱色譜分離條件，實現(xiàn)了甜味劑組分的完全、快速分離；能滿足膠基型嚼煙中甜味劑簡單、快速、準確檢測的要求；②對10 種膠基型嚼煙中各種甜味劑的檢測結(jié)果表明樣品中甜味劑的添加情況處于安全范圍。