透明質(zhì)酸酶治療透明質(zhì)酸動(dòng)脈栓塞兔耳皮膚缺血性病變的療效觀察

莊巖 劉春軍 楊明勇

透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）是目前使用最為廣泛的面部注射填充材料。常見并發(fā)癥包括淤青、紅腫和結(jié)節(jié)[1]。最嚴(yán)重的并發(fā)癥莫過于血管栓塞造成的組織缺血[2-3]，栓塞嚴(yán)重或未及時(shí)治療，病灶缺血程度將逐漸加重，并最終出現(xiàn)皮膚軟組織壞死、瘢痕形成、面容不同程度損毀[4-11]。除了阻塞于注射點(diǎn)局部的動(dòng)脈，HA 栓子還能夠在注射壓力的作用下沿受累動(dòng)脈逆行，阻塞于視網(wǎng)膜動(dòng)脈和腦動(dòng)脈[12-15]。

對(duì)于HA 引起的動(dòng)脈栓塞并發(fā)癥目前尚缺乏確切和統(tǒng)一的治療。在條件允許的情況下，溶栓、再通血管治療是改善急性動(dòng)脈栓塞組織缺血的最佳方式。傳統(tǒng)的溶栓藥物（如尿激酶、鏈激酶等）只能針對(duì)性地溶解血栓栓子，尚無證據(jù)表明其對(duì)HA 栓子有效。在兔耳動(dòng)脈栓塞模型上，我們嘗試在血管內(nèi)應(yīng)用透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HAase）來溶解HA 栓子，以探索HAase 血管內(nèi)應(yīng)用的可行性及其效果。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年新西蘭大白兔25 只，體質(zhì)量3.4～3.6 Kg，雌雄不限。分為5 組（每組5 只）：純栓塞對(duì)照組（Control 組）、生理鹽水全身靜脈溶栓對(duì)照組（Intravenous thrombolysis with NaCl,IVT-NaCl 組）、HAase全身靜脈溶栓治療組（Intravenous thrombolysis with HAase,IVT-HAase 組）、生理鹽水選擇性動(dòng)脈溶栓對(duì)照組（Intra-arterial thrombolysis with NaCl,IATNaCl 組）、HAase 選擇性動(dòng)脈溶栓治療組（Intra-arterial thrombolysis with HAase,IAT-HAase 組），均行右耳手術(shù)，經(jīng)左耳耳后靜脈外側(cè)支或耳前靜脈注射熒光素鈉進(jìn)行熒光造影檢查。

1.2 試劑與儀器

注射用修飾透明質(zhì)酸鈉凝膠（華煕福瑞達(dá)生物醫(yī)藥有限公司），注射用熒光素鈉溶液（3 mL/0.6 g，廣州白云山明興制藥有限公司），注射用HAase（1 500 U/瓶，上海第一生化藥業(yè)有限公司）。

氣密性Hamilton 100 μL 微量進(jìn)樣器（瑞士Hamilton 公司），365 nm 紫外線手電筒（安富電子有限公司），靜脈留置針（24 G×19 mm/Y-G，威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建立兔耳島狀皮瓣HA 動(dòng)脈栓塞皮膚缺血模型

參照文獻(xiàn)[16]，注射20 μL HA 進(jìn)行動(dòng)脈栓塞。

1.3.2 全身靜脈溶栓治療

IVT-NaCl 組：將12 mL 生理鹽水裝在20 mL注射器內(nèi)并安裝在KL-60 注射泵上，在HA 動(dòng)脈栓塞皮瓣制作完成后40～50 min 經(jīng)后肢隱靜脈給藥，給藥速度為12 mL/h，連續(xù)給藥1 h。

IVT-Haase 組：按10 000 U/Kg 計(jì)算HAase 給藥劑量，并將其溶于12 mL 生理鹽水內(nèi)，給藥方式、速度和時(shí)間同IVT-NaCl 組。

1.3.3 經(jīng)頸外動(dòng)脈選擇性溶栓治療

HA 動(dòng)脈栓塞皮瓣制作完成后，實(shí)驗(yàn)兔仰臥位，頸部備皮消毒，在頸部正中及右側(cè)下頜角水平設(shè)計(jì)T 形切口；切開并尋找右側(cè)頸總動(dòng)脈，在舌骨端離斷下頜舌骨肌，更好地暴露顳淺下頜干和舌面干；結(jié)扎并離斷舌面干，結(jié)扎點(diǎn)盡量遠(yuǎn)離顳淺下頜干和舌面干分叉處。動(dòng)脈夾臨時(shí)夾閉頸外動(dòng)脈主干近端、顳淺下頜干遠(yuǎn)端，之后經(jīng)舌面干斷端插入24 G 靜脈留置針并用7-0 聚丙烯縫線結(jié)扎固定，靜脈留置針針尖位于頸外動(dòng)脈主干之內(nèi)。確定無出血后打開動(dòng)脈夾和輸液泵開關(guān)，開始給藥?？筛鶕?jù)情況適當(dāng)調(diào)節(jié)插管深度，但針尖不能超過頸內(nèi)動(dòng)脈發(fā)出水平。

IAT-NaCl 組：直接給以12 mL 生理鹽水，給藥速度12 mL/h，連續(xù)給藥1 h。

IAT-HAase 組：按10 000 U/Kg 計(jì)算HAase 給藥劑量，并將其溶于12 mL 生理鹽水內(nèi)，給藥方式、速度和時(shí)間同IAT-NaCl 組給藥完成后，在舌面干近端預(yù)置7-0 聚丙烯縫線，雙人操作，在拔出靜脈留置針的同時(shí)結(jié)扎縫線；確定無出血后縫合皮膚，切口涂紅霉素藥膏。

1.3.4 術(shù)后觀察

1.3.4.1 大體觀察

觀察實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)食、排泄、體質(zhì)量等全身狀況；觀察IVT-NaCl 組和IVT-HAase 組后肢隱靜脈穿刺處皮膚情況，以及IAT-NaCl 組和IAT-HAase 組頸部切口情況

1.3.4.2 皮瓣觀察

觀察皮瓣顏色和腫脹程度，以及皮瓣下有無出血、積液、積膿、皮瓣有無壞死；術(shù)后4 h、3 d、7 d 拍照并記錄，同時(shí)進(jìn)行FA 檢查，觀察皮瓣灌注情況。麻醉后20%熒光素鈉15 mg/Kg 經(jīng)左側(cè)耳后靜脈外側(cè)支或耳前靜脈注射，10 min 后暗室下365 nm 紫外線手電筒照射皮瓣，觀察熒光充盈范圍和部位，拍照記錄。

1.3.5 術(shù)中要點(diǎn)及術(shù)后注意事項(xiàng)

兩種溶栓治療過程中，均需保證麻醉狀態(tài)，尤其是選擇性動(dòng)脈溶栓時(shí)，麻醉不足可導(dǎo)致插管脫出；分離和暴露頸外動(dòng)脈及其分支時(shí)，可見粗大的迷走神經(jīng)，不可損傷，否則會(huì)影響呼吸運(yùn)動(dòng)；分離頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端分支時(shí)，有舌面干主干缺如的情況，此時(shí)可同時(shí)結(jié)扎并離斷舌動(dòng)脈和面動(dòng)脈，以保證兩種不同的解剖分支情況下，藥物最終均進(jìn)入顳淺下頜干中，無額外的面動(dòng)脈或舌動(dòng)脈分流；在掌握頸外動(dòng)脈分支解剖、雙人熟練手術(shù)操作的基礎(chǔ)上，通?？稍贖A 動(dòng)脈栓塞皮瓣制作完成后40～50 min 開始選擇性動(dòng)脈給藥治療。在完成頸外動(dòng)脈插管后需盡早開啟輸液泵開關(guān)，否則靜脈留置針前端可有血栓形成。

1.4 結(jié)果評(píng)價(jià)

觀察各組術(shù)后4 h、3 d、7 d 皮瓣成活和灌注情況，計(jì)算并比較各組術(shù)后7 d 皮瓣灌注面積百分比的差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以SPSS16.0 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 全身狀況

每次麻醉蘇醒后，實(shí)驗(yàn)兔可逐漸恢復(fù)飲水、進(jìn)食和活動(dòng)，但進(jìn)食量均少于術(shù)前。術(shù)后前3 天，IATHAase 組、IAT-NaCl 組進(jìn)食減少相對(duì)明顯，體質(zhì)量下降100～300 g 不等，之后進(jìn)食情況逐漸改善，術(shù)后7 d 基本接近術(shù)前水平。其余各組實(shí)驗(yàn)白兔全身狀況無明顯變化。所有實(shí)驗(yàn)白兔兩便正常，尿液呈黃綠色，具有熒光性。

2.2 隱靜脈穿刺處皮膚/頸部切口情況

IVT-NaCl 組、IVT-HAase 組后肢隱靜脈穿刺處周圍皮膚可見輕度水腫，未見血腫、皮膚壞死發(fā)生。IAT-NaCl 組、IAT-HAase 組所有頸部切口愈合良好，無感染和切口裂開發(fā)生。

2.3 皮瓣肉眼觀察及FA 檢查

各術(shù)后4 h、3 d、7 d 皮瓣肉眼觀察顯示：所有皮瓣水腫程度相似，各組均有不同程度的皮瓣下積液出現(xiàn)；術(shù)后6 d，IAT-NaCl 組有1 例皮瓣發(fā)生切口部分裂開；術(shù)后7 d，除IAT-HAase 組的1 例皮瓣完全成活外，其他皮瓣均有不同程度的壞死，壞死灶位于皮瓣的遠(yuǎn)端或者邊緣。

各組術(shù)后4 h、3 d、7 d 皮瓣FA 檢查結(jié)果顯示：術(shù)后4 h，除IAT-HAase 組的1 例皮瓣熒光充盈均勻、邊界清晰外，其他所有皮瓣的熒光均呈現(xiàn)花斑狀，邊界不清；術(shù)后3 d，所有皮瓣近心端熒光充盈均勻、邊界清晰；術(shù)后7 d，所有皮瓣的灌注范圍均大于各自術(shù)后3 d 時(shí)的檢查結(jié)果，除IAT-HAase 組的1 例皮瓣100%熒光充盈外，其他皮瓣遠(yuǎn)端均有不同程度的無灌注區(qū)。

2.4 術(shù)后7 天各組皮瓣灌注面積百分比比較

術(shù)后7 d，Control 組、IVT-NaCl 組、IVT-HAase組、IAT-NaCl 組、IAT-HAase 組皮瓣平均灌注面積百分比分別為（76.54%±6.92%）、（74.08%±9.14%）、（76.94%±6.68%）、（76.95%±8.72%）和（95.47%±3.38%）。其中，IAT-HAase 組皮瓣灌注面積百分比顯著高于其他4 組（P＜0.05），其他4 組兩兩比較均無顯著差異（P＞0.05）（圖1）。

圖1 各組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)皮瓣觀察和FA 檢查Fig.1 Flap and FA examination of each group at different time points

3 討論

血管栓塞造成的組織缺血是HA 注射后最嚴(yán)重的并發(fā)癥[2-3]，不但會(huì)導(dǎo)致患者面容不同程度的損毀，還可能造成視網(wǎng)膜動(dòng)脈甚至腦血管栓塞[4-15]。雖然，HA 動(dòng)脈栓塞的發(fā)生率低，但因龐大的注射人數(shù)和不斷上升的趨勢(shì)，其總體發(fā)病例數(shù)不容小覷。近年來，該并發(fā)癥屢見報(bào)道，其后果和代價(jià)是極為慘痛的。

HAase 亦稱為玻璃酸酶，是一種能夠降低HA活性、提高組織中液體滲透能力的酶。在整形外科領(lǐng)域，HAase 常用于矯正HA 注射后的各種并發(fā)癥。HA 填充過度引起皮下腫塊或硬結(jié)時(shí)，局部注射HAase 可使腫塊或結(jié)節(jié)緩解吸收[17]。HA 意外注射進(jìn)入動(dòng)脈可引起鼻唇溝、鼻部、眉間、額部等處皮膚缺血甚至壞死[4-8，11，18]。除熱敷、按摩、氧療、擴(kuò)血管、抗凝等非特異性治療外[19]，若早期行HAase 局部注射治療，有可能阻止缺血進(jìn)展而導(dǎo)致的組織壞死[11，20]。但不同文獻(xiàn)對(duì)局部注射HAase 緩解皮膚缺血的應(yīng)用劑量相差甚遠(yuǎn)。Vartanian 等[21]認(rèn)為應(yīng)從5～10 U 開始小劑量使用。Hirsch 等[18]使用的劑量為30 U。Sun 等[11]是將150 U HAase 溶于1 mL 生理鹽水中進(jìn)行注射治療，嚴(yán)重者使用300 U HAase 溶于2 mL 生理鹽水中。DeLorenzi[1]建議盡可能使用大劑量HAase，發(fā)生血管栓塞并發(fā)癥時(shí)最大用量可到1 500 U。雖然部分組織缺血情況可以得到改善，但是局部注射的HAase 是跨血管直接溶解了動(dòng)脈內(nèi)外源性HA 栓子而改善了組織缺血，還是通過溶解組織基質(zhì)中的HA 成分、易化了組織養(yǎng)分供給而間接發(fā)揮改善組織供血的效應(yīng)尚不得知。臨床上因注射層次深淺不一、血管間存在吻合、血管走行變異等因素，往往很難確定動(dòng)脈栓塞的準(zhǔn)確位置。此外，局部皮下注射HAase 并不適合治療栓塞部位遠(yuǎn)離HA 注射點(diǎn)的眼部和腦部動(dòng)脈栓塞這兩種嚴(yán)重的栓塞并發(fā)癥。上述因素共同限制了HAase 局部注射改善HA 動(dòng)脈栓塞在組織缺血中的應(yīng)用。

全身應(yīng)用HAase 的研究早在上世紀(jì)70 年代就有報(bào)道，當(dāng)時(shí)主要是靜脈給藥用于治療急性心肌梗死[22-27]。通過阻斷狗的冠狀動(dòng)脈建立急性心梗模型，Wolf 等[28]發(fā)現(xiàn)5 000 U/Kg 的HAase 單次靜脈滴注能夠降低心肌組織內(nèi)HA 含量。Nilsson 等[22]證實(shí)了HAase 對(duì)大鼠梗死心肌的保護(hù)作用。Maroko 等[25]采用多次HAase 靜脈給藥的方式治療了24 例心?；颊?，單次藥物劑量為500 U/Kg，證實(shí)HAase 能夠減輕人心肌缺血性損傷。2000 年，Johnsson 等[29]給予同種異體心臟移植后的大鼠靜脈HAase 治療，最小劑量為5 000 U/Kg·h，單次快速靜脈注射并持續(xù)靜脈滴注2 h，最大使用劑量為20 000 U/Kg·h，單次快速靜脈注射并持續(xù)靜脈滴注4 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌中HA 和心肌間質(zhì)含水量明顯降低，且使用劑量越大，治療效果越明顯。HAase 心肌保護(hù)作用的機(jī)制主要包括減輕心肌水腫、通過解聚黏多糖增加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流入缺血區(qū)、促進(jìn)有害代謝物流出、保留心肌血流、對(duì)微血管的直接保護(hù)作用[23]。

HAase 靜脈使用具有良好的藥物安全性[25，30]。以狗和兔子為研究對(duì)象時(shí)，快速靜脈注射HAase 500 U/Kg，每日6 次，連續(xù)2 周，腦、心肌及瓣膜、肺、大動(dòng)脈、肝臟、脾、性腺、眼、晶體、椎間盤，組織病理學(xué)檢查均未見異常。健康人靜脈注射HAase 500 U/Kg，每日5 次，連續(xù)48 h，亦未見臨床并發(fā)癥，生命體征、血磷酸肌酸激酶、乳酸脫氫酶、谷-草轉(zhuǎn)氨酶、血電解質(zhì)、膽紅素、尿素氮、尿液分析、血常規(guī)、心電圖和胸片檢查均未見異常[25]。

Seifter 等[30]指出，靜脈注射HAase 后5 min，血中HAase 水平達(dá)到峰值，30 min 時(shí)活性降低一半，60 min 后無法檢測(cè)到HAase。Wolf 等[31]發(fā)現(xiàn)，靜脈注射的HAase 在人、狗、大鼠的循環(huán)中半衰期均小于10 min。實(shí)驗(yàn)狗結(jié)果顯示，500 U/Kg 和5 000 U/Kg組血清HAase 活性分別在給藥后10 min 和45 min下降到無法檢出的水平。血漿HAase 活性降低是物理性排泄清除的結(jié)果，而非酶的活性受到抑制或失活。上述兩項(xiàng)藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果說明，HAase在循環(huán)中將被迅速清除，重復(fù)靜脈注射并不能使血漿HAase 濃度持續(xù)升高。

基于HAase 靜脈使用的可行性和安全性，本研究首先進(jìn)行了HAase 全身靜脈給藥溶栓的研究。雖然國(guó)內(nèi)外尚無HAase 靜脈滴注治療外源性交聯(lián)型HA 的報(bào)道，但考慮到HAase 在循環(huán)中的半衰期非常短，為了保證HAase 可以更好地發(fā)揮溶栓作用，必須保證足夠的藥物濃度和給藥時(shí)間。因此，本研究采用連續(xù)輸液1 h 的給藥方式，并設(shè)定了較高的給藥劑量10 000 U/Kg（1 只3.6 Kg 的實(shí)驗(yàn)白兔需24支HAase）。遺憾的是，Control 組、IVT-NaCl 組、IVTHAase 組術(shù)后7 d 時(shí)皮瓣灌注面積百分比并無顯著性差異，也就是說在單次劑量10 000 U/Kg、連續(xù)靜脈給藥1 h 的情況下，HAase 并沒有顯示出溶栓作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證HAase 的溶栓作用，在給藥方式不變的情況下，需要繼續(xù)提高給藥劑量，但隨之而來的是可能伴發(fā)的藥物副作用。此外，研究進(jìn)行過程中，HAase 采購(gòu)形勢(shì)嚴(yán)峻，一藥難求，也限制了繼續(xù)提高藥物劑量進(jìn)行靜脈溶栓的可行性。

全身靜脈溶栓時(shí)，藥物首先經(jīng)下腔靜脈回心，再經(jīng)左心進(jìn)入主動(dòng)脈，只有很少一部分HAase 經(jīng)右側(cè)頸外動(dòng)脈最終進(jìn)入到右側(cè)耳郭后動(dòng)脈，即HA 動(dòng)脈栓塞的部位，因此絕大部分藥物并未在HA 動(dòng)脈栓塞處發(fā)揮作用。HAase 在循環(huán)中半衰期短，經(jīng)過若干個(gè)體循環(huán)再次回心并進(jìn)入耳郭后動(dòng)脈的HAase 活性已經(jīng)開始降低，溶栓作用進(jìn)一步變?nèi)酢?duì)于血栓栓塞的病例，臨床研究已經(jīng)證實(shí)選擇性動(dòng)脈溶栓的效果明顯優(yōu)于靜脈溶栓[32-33]。因此，在HAase 半衰期短、全身靜脈溶栓無效、藥品數(shù)量有限的情況下，本研究變換了給藥方式，從靜脈溶栓轉(zhuǎn)換為選擇性動(dòng)脈溶栓，通過提高局部藥物濃度驗(yàn)證HAase 的溶栓作用。有關(guān)HAase 動(dòng)脈應(yīng)用的研究，此前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

制作HA 動(dòng)脈栓塞皮膚缺血模型時(shí)栓塞的耳郭后動(dòng)脈系顳淺動(dòng)脈的主要分支，后者系頸外動(dòng)脈的分支之一，故可以經(jīng)頸外動(dòng)脈注射HAase 進(jìn)行選擇性動(dòng)脈溶栓效果的研究。在不具備數(shù)字減影血管造影設(shè)備和研究經(jīng)費(fèi)有限的情況下，本研究選擇通過頸外動(dòng)脈的其他分支（舌面干/舌動(dòng)脈/面動(dòng)脈）向頸外動(dòng)脈置管給藥，進(jìn)行選擇性動(dòng)脈溶栓。

術(shù)后7 d，IAT-NaCl 組和Control 組相比，皮瓣灌注面積百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也就是說頸外動(dòng)脈置管、局部給藥所造成的血流動(dòng)力學(xué)改變并未影響到皮瓣的灌注。而IAT-HAase 組皮瓣灌注面積百分比顯著高于Control 組、IVT-NaCl 組、IVT-HAase組、IAT-NaCl 組，充分證明了HAase 選擇性動(dòng)脈溶栓治療的有效性。

HAase 在循環(huán)中的半衰期非常短，從理論上講主要在早期發(fā)揮溶解HA 栓子的效應(yīng)，但術(shù)后4 h FA 檢查熒光邊界不清、很難計(jì)算皮瓣灌注面積。有關(guān)HAase 動(dòng)脈溶栓的機(jī)制，我們推測(cè)始動(dòng)環(huán)節(jié)是局部高濃度的HAase 直接溶解了部分HA，進(jìn)而產(chǎn)生以下幾方面的后續(xù)效應(yīng)：①直接減少了栓子數(shù)量、縮小了缺血組織的范圍；②栓子數(shù)量減少可以減輕動(dòng)脈的擴(kuò)張，從而減少對(duì)血管內(nèi)皮造成的影響；③降低了栓塞動(dòng)脈內(nèi)的壓力、提高了動(dòng)脈灌注壓，有利于組織再灌注；④栓子中非交聯(lián)的HA 成分被溶解后，交聯(lián)的HA 顆粒間可能會(huì)出現(xiàn)微小空隙，有利于HA在動(dòng)脈內(nèi)重新分布，并為血液和氧的彌散創(chuàng)造可能的空間；⑤即便不能夠被充分溶解，但部分交聯(lián)的HA 顆?？赡茉贖Aase 的作用下變小，有助其通過微循環(huán)或者動(dòng)靜脈吻合，甚至通過靜脈回流被帶出缺血皮瓣。其他可能的機(jī)制還包括HAase 跨血管溶解了組織中的HA、減輕了皮瓣水腫、進(jìn)而改善了循環(huán)，HAase 對(duì)微血管的直接保護(hù)作用等[23]。本研究采用島狀皮瓣驗(yàn)證HAase 血管內(nèi)應(yīng)用的溶栓效果，HAase 進(jìn)入缺血皮瓣的途徑僅為阻塞的單一動(dòng)脈。若采用的皮瓣為非島狀皮瓣，將有更多HAase 被帶入缺血區(qū)，HAase 有可能會(huì)發(fā)揮更好的溶栓效果。

本研究初步證實(shí)了HAase 選擇性動(dòng)脈溶栓的有效性，為醫(yī)源性HA 動(dòng)脈栓塞尋找了新的治療可能，該方法不但可用于改善皮膚軟組織缺血，還有望治療眼動(dòng)脈和腦動(dòng)脈栓塞這兩種更為嚴(yán)重的HA 動(dòng)脈栓塞并發(fā)癥。

本研究的局限性：①樣本觀察量小；②僅采用了單一劑量的單次治療，并未進(jìn)行不同劑量HAase 溶栓效果的比較觀察；③由于HAase 對(duì)不同性狀（單相或雙相，交聯(lián)或非交聯(lián)型）、不同交聯(lián)度、不同生產(chǎn)工藝的HA 產(chǎn)品分解能力不同，本研究結(jié)果并不能用于其他劑型的HA 產(chǎn)品。無論是靜脈全身溶栓，還是選擇性動(dòng)脈溶栓，均屬于HAase 商品標(biāo)識(shí)外用藥（超適應(yīng)證、超用藥途徑），且研究中HAase 使用劑量遠(yuǎn)大于Maroko 等用來評(píng)價(jià)藥物安全性的劑量[25]，后續(xù)研究還需進(jìn)一步評(píng)價(jià)此劑量使用的安全性，尤其需要警惕大劑量使用時(shí)過敏的風(fēng)險(xiǎn)。