改良聯(lián)合酶消化法制備人瘢痕疙瘩組織單細胞懸液的實驗研究

黃昕 徐祥文 高雅姍 李海洲 顧舒晨 鄺依敏 昝濤

瘢痕疙瘩是繼發(fā)于皮膚外傷或自發(fā)形成和過度生長的病理性瘢痕組織，由于瘢痕疙瘩的發(fā)病機制尚未完全闡明，因此臨床治療難度較大[1]。目前認為，瘢痕疙瘩的形成是以成纖維細胞功能紊亂為主、多種微環(huán)境細胞共同參與的復雜過程[2]。近年來，細胞流式技術(shù)和單細胞組學技術(shù)的發(fā)展使人們能夠從單細胞層面，以基因組、轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及蛋白組等多個角度，對復雜的細胞群體進行精細的鑒定和分析[3]。在皮膚研究領(lǐng)域，單細胞組學技術(shù)的應(yīng)用進一步明確了皮膚中的細胞亞群[4-6]，及其在衰老[7]、創(chuàng)面愈合[8]等方面的生理和病理學機制。上述研究提示，從單細胞水平對瘢痕疙瘩組織中的細胞亞群和細胞功能變化規(guī)律進行研究，可以進一步揭示瘢痕疙瘩的發(fā)病機制。

將組織制備成單細胞懸液是單細胞研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。但是，瘢痕疙瘩組織質(zhì)地堅硬，真皮層有大量致密的膠原沉積[9]，消化難度大。通常，瘢痕疙瘩組織的消化采用的是以膠原酶為主的酶消化法[10-12]，但是前期報道的酶消化法主要用于提取組織中的原代成纖維細胞，消化得到的細胞懸液中含有大量細胞團塊，未能達到單細胞懸液制備的要求。近期，有研究報道采用聯(lián)合酶消化法制備真皮組織的單細胞懸液，獲得了較好的消化效果，但是并未嘗試用于瘢痕疙瘩組織的消化[6，13]。

本文對傳統(tǒng)聯(lián)合酶消化法進行改進，探討改良聯(lián)合酶消化法對于瘢痕疙瘩真皮組織的消化效果，包括組織消化獲得的單細胞比例、單細胞數(shù)量以及細胞活性，并探究達到最佳消化效果需要的消化時間，為制備瘢痕疙瘩組織的單細胞懸液提供新方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶（Gibco 公司，美國），透明質(zhì)酸酶、DNaseⅠ（Sigma 公司，美國）、中性蛋白酶（Roche，瑞士），Masson 組織染色試劑盒（南京建成科技有限公司），臺盼藍染色液、紅細胞裂解液（Biosharp，中國），流式細胞染色緩沖液、PI 染料（BD 公司，美國）。

超凈工作臺、倒置相差顯微鏡（Nikon 公司，日本）、流式細胞分析儀（LSRFortessa X-20，BD 公司，美國）。

1.2 瘢痕疙瘩組織的保存和Masson 染色

收集手術(shù)切除后廢棄的瘢痕疙瘩組織樣本8 例（獲我院轉(zhuǎn)化醫(yī)學倫理審查專委會審議通過，批件號：2018-129-T107），剪成0.5 cm×0.5 cm 大小保存于4%多聚甲醛中，48 h 后常規(guī)石蠟包埋，橫斷面4 μm 厚連續(xù)切片，行Masson 染色。其余樣本浸泡于含有5%雙抗的組織保存液中，1 h 后進行組織消化。Masson 染色根據(jù)說明書進行：組織切片經(jīng)過脫蠟、復水后核染液染色60 sec，PBS 水洗30 sec，漿染液染色60 sec，PBS 水洗30 sec，黃色分色液分色6 min，藍色復染液染色5 min，無水乙醇沖洗，風干后封片。

1.3 實驗分組和消化酶的配制

將8 例瘢痕疙瘩組織從組織保存液中取出，浸沒于75%乙醇溶液中30 sec，取出后PBS 充分清洗3 次。將組織切成5 mm×5 mm 大小，加入0.3%中性蛋白酶消化液，液體體積為組織體積的2 倍，置于37 ℃搖床100 r/min 消化1 h。撕去表皮，將真皮組織用剪刀勻漿。

本實驗分為兩部分進行。第一部分實驗對比A、B 兩種方案（A、B 組）的消化效率。在該部分實驗中，取3 例樣本，每例樣本取兩份500 μL 的真皮組織勻漿，分別用A、B 方案在37 ℃搖床（100 r/min）上消化2 h、4 h。第二部分實驗進一步確定B 方案達到最佳消化效果需要的消化時間。在該部分實驗中，取5 例樣本，每例樣本取500 μL 的真皮組織勻漿，用B 方案在37 ℃搖床（100 r/min）上消化4 h、6 h、8 h和10 h。消化完成后，用40 μm 的濾網(wǎng)過濾消化液，1 000 r/min 離心8 min，棄上清。細胞沉淀中加入500 μL 的紅細胞裂解液，室溫裂解2 min 后加入5 mL 的PBS 中和裂解，1 000 r/min 離心8 min，棄上清。細胞沉淀中加入200 μL 流式細胞染色緩沖液重懸。

A 方案為傳統(tǒng)聯(lián)合酶消化法，配制方法：DMEM高糖培養(yǎng)基中加入1.25 mg/mL Ⅰ型膠原酶，0.5 mg/mLⅡ型膠原酶，0.5 mg/mL Ⅳ型膠原酶，0.1 mg/mL 透明質(zhì)酸酶，1% 雙抗。B 方案采用改良聯(lián)合酶消化法，即在A 方案的基礎(chǔ)上添加0.1 mg/mL DNaseⅠ。

1.4 單細胞比例和單細胞數(shù)的計算

取10 μL 細胞懸液滴于細胞計數(shù)板，用倒置相差顯微鏡拍照記錄組織消化情況。計數(shù)消化得到的單細胞數(shù)，并計算單細胞比例。單細胞數(shù)=細胞濃度（cells/mL）×0.2 mL。單細胞比例=[單細胞數(shù)/（單細胞數(shù)+細胞團數(shù)）]×100%。

1.5 細胞活性的檢測

1.5.1 臺盼藍染色計數(shù)細胞成活率

取10 μL 細胞懸液，與0.2%的臺盼藍染液1∶1混合，室溫下放置2 min，將混合液滴于細胞計數(shù)板，對臺盼藍染色陽性的死細胞和染色陰性的活細胞進行計數(shù)，細胞成活率=[活細胞數(shù)/（活細胞數(shù)+死細胞數(shù)）]×100%。

1.5.2 流式細胞學檢測細胞活性

取100 μL 細胞懸液，在其中加入1 μL 的PI 染料，吹打混勻，室溫孵育1 min 后進行流式細胞檢測。活細胞不能被PI 染料染色，死細胞的細胞膜會出現(xiàn)破損，PI 染料與細胞核內(nèi)的染色體結(jié)合，發(fā)出熒光。用Flowjo 軟件對數(shù)據(jù)進一步分析和繪圖。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用Graphpad prism 6 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和繪圖，所有計量資料以（）表示。B 組消化方案消化4 h、6 h、8 h 和10 h 的結(jié)果采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 法。A 組和B 組消化2 h、4 h 的結(jié)果用雙因素方差分析，兩兩比較采用Sidak法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕疙瘩的組織學特征

Masson 染色顯示瘢痕疙瘩組織最為特征性的改變是真皮深層細胞增生活躍、膠原高度沉積的增生結(jié)節(jié)區(qū)，該區(qū)膠原纖維排列紊亂，形成粗大的纖維條索和結(jié)節(jié)。這提示在制備單細胞懸液的過程中，需要大量降解膠原成分的酶，以釋放包裹于致密細胞外基質(zhì)中的細胞（圖1）。

圖1 瘢痕疙瘩組織Masson 染色（PD：真皮乳頭層；RD：真皮網(wǎng)狀層；標尺：10 μm）Fig.1 Masson staining of keloid tissue (PD:papillary dermis;RD:reticular dermis;Scale bar:10 μm)

2.2 A 組和B 組消化效率的比較

消化2 h 后對細胞懸液進行鏡檢發(fā)現(xiàn)，A 組和B 組仍有大量組織團塊殘留，消化不充分，單細胞比例和單細胞數(shù)量較少。當消化時間延長至4 h，消化得到的單細胞數(shù)和單細胞比例明顯提高。其中，B 組消化得到的單細胞比例（71.87%±4.88% &59.67%±2.62%，P＜0.05）和單細胞數(shù)（4.34×105±0.26×105&2.60×105±0.56×105，P＜0.01）顯著高于A 組，提示通過添加DNaseⅠ，可有效提高組織消化效率（圖2）。

2.3 B 組消化不同時長的組織消化效果

2.3.1 不同消化時長的單細胞比例和單細胞數(shù)

對采用B 方案消化不同時長的細胞懸液進行鏡檢發(fā)現(xiàn)，消化6 h、8 h 和10 h 時的組織消化程度優(yōu)于4 h，視野內(nèi)細胞團塊數(shù)明顯減小。消化6 h獲得單細胞比例（84.4%±5.78% &62.40%±6.04%，P＜0.01）和單細胞數(shù)（11.16×105±0.90×105&4.60×105±0.78×105，P＜0.01）相較消化4 h 顯著升高。延長消化時間至8 h和10 h，單細胞比例相比消化6 h 有所升高，但差異不明顯（P＞0.05），提示消化6 h 基本能夠獲得組織的充分消化；而消化8 h 和10 h 獲得的單細胞數(shù)相較消化6 h 略微降低，沒有顯著性差異（P＞0.05），可能是消化時間過長導致細胞損傷和破裂（圖3）。

2.3.2 不同消化時長得到的細胞活性

臺盼藍染色檢測細胞懸液中的細胞活性可以發(fā)現(xiàn)，消化6 h 獲得的活細胞率比4 h 有所下降，但差異不明顯（86.12%±3.32% &88.51%±3.89%，P＞0.05）。當消化時間延長到8 h 和10 h，細胞活性比消化6 h顯著降低（77.02%±3.62% &86.12%±3.32%，P＜0.01；68.24%±5.92% &86.12%±3.32%，P＜0.01）。通過計算PI 染色陰性細胞所占的比例確定活細胞率，同樣發(fā)現(xiàn)消化6 h 與消化4 h 獲得的活細胞率無統(tǒng)計學差異（83.66%±2.95%&88.42%±2.95%，P＞0.05）。當消化時間延長到8 h 和10 h，活細胞比例相比消化6 h顯著降低（73.56%±3.72% &83.66%±2.95%，P＜0.05；58.92%±6.21% &83.66%±2.95%，P＜0.01）（圖4）。

圖2 A 組與B 組消化2 h 和4 h 的組織消化效果Fig.2 Results of tissue digestion after 2 hours and 4 hours digestion in group A and group B

圖3 B 組消化4 h、6 h、8 h 和10 h 的組織消化效果Fig.3 Results of tissue digestion after 4 hours,6 hours,8 hours and 10 hours digestion in group B

圖4 B 組消化4 h、6 h、8 h 和10 h 的細胞活性Fig.4 Cell viability after 4 hours,6 hours,8 hours and 10 hours digestion in group B

3 討論

目前，皮膚組織的消化沒有固定的方案，最為常用的是酶消化法。中性蛋白酶能有效降解細胞和細胞外基質(zhì)間的連接蛋白，對細胞間連接和細胞本身幾乎不造成影響，故常被用于表皮和真皮的分離[14]。膠原是真皮組織中主要的細胞外基質(zhì)成分。因此，真皮組織的消化主要依賴各種類型的膠原酶。其中，有采用單一類型的膠原酶（如Ⅰ型膠原酶[10]或Ⅳ型膠原酶[11]）對瘢痕疙瘩組織進行消化，也有使用粗制的混合膠原酶[12]（包含Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶等）進行消化。但是，由于其目的在于提取成纖維細胞，因而在單細胞比例上沒有明確要求，消化得到的細胞懸液中包含大量細胞團塊，無法達到單細胞懸液的制備要求。近年來，隨著單細胞檢測技術(shù)的興起，人們對真皮組織的消化程度提出了更高的要求。相繼有研究報道了正常皮膚單細胞懸液的制備方法，能夠滿足常規(guī)流式細胞檢測和單細胞測序的要求[4-6，13]。其中主要的消化方式分為兩種：一種是皮膚消化試劑盒（Whole skin dissociation kit）和配套的組織消化儀（gentleMACS Dissociator）[4-5]，另一種是聯(lián)合酶消化法[6，13]。由于條件限制，本研究并未購置組織消化儀，因此主要討論聯(lián)合酶消化法及其改進方案。聯(lián)合酶消化法采用混合酶溶液（1.25 mg/mL Ⅰ型膠原酶、0.5 mg/mL Ⅱ型膠原酶、0.5 mg/mL Ⅳ型膠原酶和0.1 mg/mL 透明質(zhì)酸酶）在37 ℃消化真皮組織1 h，可以將組織有效消化，消化后的細胞表面抗原，如成纖維細胞抗原CD90、FAP、CD36 等保存良好，能夠進行后續(xù)的流式細胞檢測和原代細胞培養(yǎng)[6]。但是，該方案在消化瘢痕疙瘩時顯得效率不足，預(yù)實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過1 h 的消化，細胞懸液中仍有大量聚集的細胞團，提示消化不完全。為了獲得更好的消化效果，必須對聯(lián)合酶消化法進行改進。

細胞成團現(xiàn)象產(chǎn)生的原因主要有兩種：對細胞間連接的消化不完全，以及細胞破裂釋放的游離DNA鏈誘導的細胞聚集[15]。為此，本研究設(shè)計了改進方案：首先，將靜置消化改為搖床震蕩消化（100 r/min）；其次，通過添加DNaseⅠ剪切磷酸二酯鍵，水解消化過程中釋放的DNA 鏈，防止細胞聚集。Broggi 等[16]在混合膠原酶（LiberaseTM）中加入50 U/mL DNaseⅠ，結(jié)果顯示該方法能夠?qū)⑿∈笃つw組織消化到單細胞水平，并完成皮膚中免疫細胞的流式分析，說明該方案能夠保持細胞表面抗原的完整性。本研究結(jié)果提示，單純通過震蕩消化，4 h 后仍無法獲得理想的消化效果。但通過添加DNaseⅠ，細胞成團現(xiàn)象明顯降低，單細胞比例明顯升高。這表明消化液中游離的DNA 鏈會嚴重影響組織消化效率，通過去除DNA鏈能有效提高消化效率，獲得更好的單細胞懸液制備效果。

消化時間是組織消化重要的考慮因素，適當延長消化時間有助于增加單細胞比例和單細胞數(shù)，但過度消化則會導致細胞碎片增多、細胞活性下降[15]。通常，消化時間超過5 h 對細胞活性影響較大，但需要針對不同的消化方案進行調(diào)整[15]。為此，本研究設(shè)置了時間梯度，以探究改良聯(lián)合酶消化法在不同消化時長下的消化效果。結(jié)果提示，組織消化6 h 能夠獲得理想的單細胞比例和單細胞數(shù)，并且細胞活性與消化4 h 相比沒有明顯差異，而繼續(xù)延長消化時間則會導致細胞成活率明顯下降。因此，采用改良聯(lián)合酶消化法的消化時間不宜超過6 h。

本研究通過改良聯(lián)合酶消化法，提出了一種制備瘢痕疙瘩組織單細胞懸液的有效方法，為從單細胞水平研究瘢痕疙瘩中的細胞類型和疾病發(fā)生機制提供了條件。但本研究亦存在一定的局限性。首先，組織單細胞懸液的制備方法有多種，本研究集中討論了聯(lián)合酶消化法及其改良方案，并未對其他消化方法進行詳盡比較，可能存在消化效果更好的方案。其次，本研究僅檢測了消化后的細胞活性，并未對細胞表面抗原的保存情況進行鑒定。理論上，本消化方案并未添加胰酶等對細胞膜破壞較大的消化酶，細胞表面抗原應(yīng)該得到較好保存，但在實際應(yīng)用過程中，應(yīng)當檢測目的抗原的保存情況。

4 結(jié)論

本研究在傳統(tǒng)聯(lián)合酶消化法的基礎(chǔ)上添加DNaseⅠ，顯著提高了組織消化效率，獲得了較好的瘢痕疙瘩消化效果。同時，本研究證明采用改良聯(lián)合酶消化法消化6 h，能夠在保持細胞活性（＞80%）的同時，獲得較好的單細胞懸液制備效果。