響應(yīng)面法優(yōu)化雙柏散中總黃酮的超聲波萃取工藝

劉建清，林水森，謝志新，謝娜娜

（泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校 藥學(xué)院，福建 泉州 362000）

雙柏散是已故名老中醫(yī)黃耀燊的經(jīng)驗(yàn)方，處方由大黃、側(cè)柏葉、黃柏、澤蘭、薄荷組成，臨床用于跌打損傷、紅腫疼痛等癥狀治療，因療效可靠、安全性高被收錄于《中醫(yī)傷科學(xué)講義》中[1-2]。

為提高雙柏散使用方便性，近年，雙柏散被研制成軟膏劑、噴霧劑、巴布劑等新劑型，其中雙柏散的提取是新劑型研發(fā)成功的關(guān)鍵，也是后續(xù)臨床應(yīng)用安全、有效的保障。目前關(guān)于雙柏散提取，尤其是提取優(yōu)化的文章報(bào)道較少。超聲波萃取是利用超聲波具有機(jī)械效應(yīng)、空氣效應(yīng)和熱效應(yīng)等特點(diǎn)，提高萃取溶劑的擴(kuò)散和滲透能力，從而促進(jìn)目標(biāo)成分提取的方法，具有無(wú)需高溫、常壓萃取、萃取率高等優(yōu)點(diǎn)[3-6]。

本研究以總黃酮為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對(duì)雙柏散超聲波萃取工藝進(jìn)行優(yōu)化，探究雙柏散最佳提取工藝，為后期雙柏散新劑型的研究提供技術(shù)參數(shù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA623S精密電子天平[Satorius（北京）]；CN-LQC3001電子天平（昆山優(yōu)科維特）；UV-2700型紫外分光光度計(jì)（島津-蘇州）； Scientz-250/500/1000c多功能恒溫超聲波萃取儀（新芝科技）；80-2電動(dòng)離心機(jī)（常州國(guó)宇）。

1.2 試藥

大黃（產(chǎn)地甘肅，批號(hào)：220102），側(cè)柏葉（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)：220302），黃柏（產(chǎn)地四川，批號(hào)210602），澤蘭（產(chǎn)地福建，批號(hào)220202），薄荷（產(chǎn)地江蘇，批號(hào)220102），均購(gòu)自銘遠(yuǎn)健康集團(tuán)有限公司。蘆丁對(duì)照品（源葉生物，批號(hào)：153-18-4），乙醇（西隴科學(xué)，批號(hào)：2109011）。

2 方法與結(jié)果

2.1 蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液配制

精確稱量蘆丁對(duì)照品0.0323 g，置50 ml量瓶中，加70 %乙醇溶解定容，搖勻，即得0.646 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2 線性與回歸方程

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液（0.646 mg/ml）0.5，1，1.5，2，2.5 ml，分別置50 ml量瓶中，加70 %乙醇定容。采用直接測(cè)定法，于254 nm處分別測(cè)定各對(duì)照品溶液吸光度（A）。以蘆丁濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)、A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得回歸方程：Y=31.194X+0.00683，r=0.9997，表明蘆丁對(duì)照品濃度在0.00646～0.0323 mg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 雙柏散總黃酮提取及測(cè)定

按處方比例稱取大黃、側(cè)柏葉等混合，粉碎成粗粉后，按液料比20加入70 %乙醇，于40 ℃下超聲20 min，經(jīng)紗布過(guò)濾取藥液于3000 r/min離心5 min，取上清0.5 ml加70 %乙醇定容至50 ml。按2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。

2.4 單因素考察

影響超聲波萃取工藝的因素較多，本試驗(yàn)通過(guò)前期考察及參考相關(guān)文獻(xiàn)[7]，最終確定乙醇濃度、液料比、超聲溫度及超聲提取功率4個(gè)因素進(jìn)行超聲波萃取單因素考察，具體考察條件見表1。

表1 單因素考察條件設(shè)計(jì)

2.4.1 不同濃度乙醇對(duì)總黃酮超聲提取率的影響 結(jié)果見圖1。

由圖1可見，當(dāng)乙醇濃度逐漸升高時(shí)，雙柏散中總黃酮的提取率呈先增后減趨勢(shì)。這可能是因?yàn)橐掖荚诘蜐舛葧r(shí)，隨著濃度升高，對(duì)總黃酮類化合物的溶解度隨之增加，但乙醇達(dá)到一定濃度后，乙醇溶液極性大小及溶解范圍出現(xiàn)變化，總黃酮類化合物的溶出量下降；同時(shí)雙柏散中的糅質(zhì)、色素等雜質(zhì)溶出增多，也干擾總黃酮的測(cè)定，進(jìn)而影響雙柏散的提取率。

2.4.2 液料比對(duì)雙柏散中總黃酮提取率的影響 結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在液料比10～25范圍內(nèi)，總黃酮提取率隨著提取溶劑量的增加而提高。在液料比20～30范圍內(nèi)，總黃酮提取率升高趨勢(shì)已不明顯，當(dāng)液料比為30時(shí)，總黃酮提取率甚至出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，這說(shuō)明總黃酮的溶出擴(kuò)散已達(dá)到平衡，增加溶劑量對(duì)總黃酮提取效果意義不大。

2.4.3 超聲萃取溫度對(duì)雙柏散中總黃酮提取率的影響 結(jié)果見圖3。

圖3 超聲萃取溫度對(duì)雙柏散中總黃酮提取率的影響

由圖3可見，30～60 ℃范圍內(nèi)，隨著超聲溫度的升高，總黃酮提取率隨之升高。但隨著溫度進(jìn)一步升高，超過(guò)60 ℃后，總黃酮提取率反而下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度升高到一定程度后，雙柏散中總黃酮類化合物被破壞，反而使提取率下降。

2.4.4 超聲功率對(duì)雙柏散中總黃酮提取率的影響 結(jié)果見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)雙柏散中總黃酮提取率的影響

由圖4可見，當(dāng)超聲功率較低時(shí)，如超聲功率為540 W時(shí)，總黃酮的提取率為7.23 %，隨著超聲功率的提高，當(dāng)超聲功率為720，900，1080，1260 W時(shí)，總黃酮的提取率為8.3 %～8.7 %。這說(shuō)明當(dāng)超聲功率達(dá)到720 W后，隨著超聲功率的提高，對(duì)于總黃酮的提取影響較小，最后將提取超聲功率定為900 W。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波萃取工藝

2.5.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素水平考察結(jié)果，選取對(duì)總黃酮提取率影響較大的因素，包括乙醇濃度、液料比、溫度3個(gè)因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化雙柏散的超聲萃取工藝，各因素水平見表2，響應(yīng)面法結(jié)果見表3。

表2 三因素三水平響應(yīng)曲面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

表3 試驗(yàn)優(yōu)化雙柏散中總黃酮超聲萃取試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5.2 線性擬合結(jié)果 用Design Expert 8.05軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性方程擬合[8-9]，以提取率（Y）為因變量，各提取因素為自變量，可得Y=8.57-0.71A+0.27B+0.17C+0.02AB-0.35AC-0.07BC-1.22A2-0.082B2-0.21C2，該模型相對(duì)應(yīng)P值<0.0001，可知該模型顯著，預(yù)測(cè)好（失擬項(xiàng)P=0.7510＞0.05），變異系數(shù)（CV）=0.96 %，可知工藝穩(wěn)定性好，可靠性高，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義，見表4。

表4 方差分析結(jié)果

2.5.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)回歸方程，做不同提取條件的響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖5。從圖中可看出不同提取條件相互作用對(duì)總黃酮提取率的影響，其中乙醇濃度和溫度的相互作用影響較為顯著。

圖5 不同因素相互作用對(duì)雙柏散中總黃酮提取效果影響的響應(yīng)面圖

2.5.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 以Design-Expert 8.05軟件優(yōu)化得總黃酮的超聲萃取工藝為：乙醇濃度62.26 %，液料比24.77，超聲溫度54.29 ℃。為方便試驗(yàn)可操作性，進(jìn)一步將超聲萃取工藝確定為乙醇濃度62 %，液料比25，超聲溫度54 ℃，按該工藝進(jìn)行3批雙柏散超聲萃取驗(yàn)證，結(jié)果顯示提取率為8.80 %±0.13 %（RSD=1.45 %，n=3），與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為2.13 %，提示模型預(yù)測(cè)較好。

3 討論

現(xiàn)代研究表明黃酮類化合物具有抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用，起到消腫止痛之功[10-12]。雙柏散中的大黃、側(cè)柏葉及澤蘭均含有黃酮類化合物，因此本試驗(yàn)選擇總黃酮為指標(biāo)優(yōu)化雙柏散的超聲萃取工藝。

超聲波萃取工藝研究中，為保證試驗(yàn)準(zhǔn)確性和平行性，在操作中應(yīng)注意一些細(xì)節(jié)，減少組間人為差異，包括超聲結(jié)束后應(yīng)迅速過(guò)濾，防止雙柏散繼續(xù)在乙醇中浸潤(rùn)；超聲過(guò)程中需用保鮮膜遮蓋，防止乙醇在超聲過(guò)程中揮發(fā)，影響總黃酮的測(cè)定。

本文在單因素考察基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化雙柏散中總黃酮的超聲萃取工藝，最終確定超聲波萃取條件為乙醇濃度62 %，液料比25，超聲溫度54 ℃，該工藝獲得的總黃酮提取率平均約8.8 %，與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果接近，表明建立的響應(yīng)面法模型可靠。