循環(huán)腫瘤DNA中HER2表達(dá)及其與胃癌預(yù)后的關(guān)系

周穎 陸麗華

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院 消化科，上海 200137

人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,HER2）是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的成員，定位于染色體17q21，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為185000的跨膜受體樣蛋白，具有酪氨酸激酶活性[1]。HER2在乳腺癌診療中的價(jià)值已被認(rèn)可，能獨(dú)立預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和生存期長(zhǎng)短，并被現(xiàn)行指南作為危險(xiǎn)分層和指導(dǎo)治療的指標(biāo)之一[2-3]。HER2過表達(dá)與胃癌預(yù)后的相關(guān)性尚不明確[4]，各項(xiàng)研究的結(jié)果不一，但Meta分析提示HER2基因擴(kuò)增及過表達(dá)與不良預(yù)后有相關(guān)性[5-6]。文獻(xiàn)報(bào)道，在胃癌早期即有腫瘤細(xì)胞DNA釋放入血，檢測(cè)循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA,ctDNA）具有無創(chuàng)、實(shí)時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，并且早于影像學(xué)檢查結(jié)果[7]。本研究采用前瞻性病例對(duì)照研究，采用微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR System，ddPCR）技術(shù)，對(duì)胃癌患者血清ctDNA中HER2基因擴(kuò)增表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分析其與腫瘤組織樣本免疫組化染色(immuno-histochemistry，IHC)結(jié)果的一致性，并分析ctDNA中HER2擴(kuò)增水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系。觀察ctDNA中HER2表達(dá)的預(yù)測(cè)價(jià)值，為實(shí)時(shí)、無創(chuàng)檢測(cè)積累數(shù)據(jù)，以實(shí)現(xiàn)靶向藥物治療患者的精準(zhǔn)篩查，從而改善患者預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

入選標(biāo)準(zhǔn)為：1）擬接受根治術(shù)的原發(fā)性胃癌患者；2）術(shù)前無放化療史；3）臨床分期ⅢA期以下，病理組織學(xué)證實(shí)為腺癌者；4）無嚴(yán)重心肺功能障礙和其他嚴(yán)重合并癥。排除合并其它惡性腫瘤史者。

1.2 一般資料

2017年1月至2017年12月于我院確診擬采用根治術(shù)治療的原發(fā)胃癌患者中，抽取術(shù)后病理符合入組標(biāo)準(zhǔn)的100例作為胃癌組。抽取同期與胃癌組年齡、性別接近的健康體檢者50例為對(duì)照組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 樣本采集

胃癌組患者術(shù)前采血，血清標(biāo)本置于-80℃凍存待檢。術(shù)中切除的腫瘤組織使用福爾馬林固定，按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行石蠟包埋。對(duì)照組入組后采血。

1.4 免疫組化檢測(cè)

常規(guī)石蠟組織切片，厚3μm，襯于涂膠玻片上，放置烤箱中(65℃)烘烤過夜；組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟 3 min×3 次，100%、95%和 75%的酒精脫水各 2 min，自來水沖洗 2 min；3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，浸泡 10 min，PBS 沖洗 3 min×3 次；EDTA 抗原修復(fù)：不銹鋼鍋內(nèi)加入配制好的 EDTA 緩沖液，電磁爐上加熱至煮沸，將切片置于耐高溫塑料切片架中，浸入已沸騰的緩沖液中，蓋好加壓閥，保溫 20 min，停止加熱，不銹鋼鍋?zhàn)匀焕鋮s 2-3 min，自來水沖洗冷卻至室溫，打開鍋蓋，取出切片，水洗 2 min，PBS 沖洗3 min×3 次；IHC油筆在組織外圍劃圈，防止滴加的抗體流失；滴加第一抗體（HER2 抗體，抗體濃度 1：150），以 PBS 緩沖液替代第一抗體，作為空白對(duì)照，37℃濕盒內(nèi)孵育 2.5 h（或過中午），PBS 沖洗 3 min×3 次；甩去 PBS 溶液，滴加即用型二抗，室溫孵育 30 min，PBS 沖洗 3 min×3 次；滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，鏡下控制顯色時(shí)間1-3 min，不超過 5 min，水洗 2min；改良無酒精Carazzi 蘇木素液復(fù)染數(shù)秒，流水洗 5 min；顯色片過酒精后烤干，用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。根據(jù)修訂的 Hercep Test 評(píng)分系統(tǒng)由 2 名專業(yè)病理醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，結(jié)果為0/陰性、1+/陰性、2+/不確定、3+/陽性。

1.5 血清ctDNA抽提

取血清350μL，加入等體積1%SDS溶液，20μL蛋白酶K（濃度為20mg/mL），混勻后60℃水浴90min。加入等體積酚：氯仿：異戊醇（5：4：1）混合溶液，劇烈震蕩，4℃靜置30min后，4℃下離心12000rpm 10min，吸取上清至新的離心管中，注意不要吸到中間乳白色液體層。加入等體積異丙醇，劇烈震蕩，-20℃靜置沉淀2h或過夜，4℃下離心12000rpm 10min，棄上清。之后用1mL 75%乙醇溶液清洗沉淀兩次，開蓋至剩余液體揮發(fā)干凈，加入ddH2O 20μl溶解沉淀，如不能溶解完全，水浴鍋中70℃水浴10min后，室溫12000rpm離心2min。

1.6 HER2的DNA標(biāo)準(zhǔn)品制備

在南京金斯瑞公司合成人HER2基因的cDNA全長(zhǎng)作為HER2標(biāo)準(zhǔn)品，用ddH2O將其溶解為濃度100ng/μL濃度使用。將其梯度稀釋至1ng/μL、10ng/μL、50ng/μL備用，作為驗(yàn)證HER2引物的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.7 微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增

HER2基因用FAM標(biāo)記的TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用RPPH1基因作為參照，探針用HEX標(biāo)記，將含有樣品DNA的反應(yīng)液通過QX200微滴發(fā)生器形成油包水的微滴，然后轉(zhuǎn)移到96孔PCR板在ABI 2720 PCR基因擴(kuò)增儀進(jìn)行兩步法的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性10min；接著95℃變性30sec，60℃退火1min，40個(gè)循環(huán)；隨后98℃加熱10min。最后再將PCR板轉(zhuǎn)移到QX200微滴分析儀對(duì)所有孔的樣品進(jìn)行熒光檢測(cè)。HER2拷貝數(shù)為HER2基因的濃度與RPPH1基因的濃度之比。結(jié)果判讀時(shí)，相對(duì)表達(dá)量大于等于1.4倍結(jié)果判讀為陽性，小于1.4倍結(jié)果判讀為陰性。所用引物見表1。

表1 ddPCR備選引物

1.8 觀察方法

比較胃癌組與對(duì)照組HER2陽性率，比較胃癌組免疫組化和數(shù)字微滴PCR結(jié)果，術(shù)后隨訪18～24個(gè)月，比較死亡和復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移預(yù)后不良患者與未復(fù)發(fā)患者的HER2基因擴(kuò)增結(jié)果。

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組與對(duì)照組ctDNA的HER2陽性率比較

胃癌組血清ctDNA的HER2基因擴(kuò)增結(jié)果41例陽性，陽性率41%，對(duì)照組陽性率2%，兩組間比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 胃癌組IHC檢測(cè)HER2表達(dá)與ddPCR擴(kuò)增結(jié)果比較

胃癌組HER2IHC檢測(cè)2+陽性9例，3+陽性34例，陽性率43%，ddPCR的基因擴(kuò)增與ICH的符合率為96%(96/100)，見表2。

表2 胃癌組HER2的IHC與ddPCR結(jié)果比較（n）

2.3 ctDNA的HER2與胃癌患者預(yù)后

100例患者中死亡11例，復(fù)發(fā)27例，預(yù)后不良率38%。ctDNA中HER2陽性患者預(yù)后不良率65.85%（27/41）,HER2陰性患者預(yù)后不良率18.64%(11/59)。HER2陽性組預(yù)后不良率顯著高于陰性組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。如圖1所示，預(yù)后不良組ctDNA中的HER2的表達(dá)量是預(yù)后良好組的8.7倍，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 預(yù)后良好與預(yù)后不良組HER2表達(dá)量

3 討論

中國屬于胃癌高發(fā)國家，每年胃癌新發(fā)病例約40萬例，死亡約35萬例，新發(fā)和死亡均占全世界胃癌病例的40%[8]，降低胃癌的發(fā)病率和死亡率是亟待解決的重大公共衛(wèi)生問題。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的不斷研究，對(duì)腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究的不斷深入，腫瘤的治療也進(jìn)入了一個(gè)嶄新的靶向治療時(shí)代。而發(fā)現(xiàn)新的胃癌預(yù)后靶標(biāo)、精準(zhǔn)篩選適合靶向治療的患者、監(jiān)測(cè)治療效果、評(píng)價(jià)預(yù)后成為目前的研究熱點(diǎn)[9]。針對(duì)HER2陽性的靶向藥物（曲妥珠單抗、拉帕替尼、帕妥珠單抗）的出現(xiàn)，使得精準(zhǔn)篩選HER2陽性的胃癌患者顯得更為至關(guān)重要。

HER2在正常情況下處于非激活狀態(tài)，當(dāng)受到體內(nèi)外某些因素作用后被激活，具有腫瘤轉(zhuǎn)化活性，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[10-11]。HER2基因擴(kuò)增及過表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后呈相關(guān)性，與胃癌的浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分期有關(guān)[12-13]。目前，HER2的檢測(cè)方法主要為對(duì)腫瘤組織樣本進(jìn)行基因擴(kuò)增檢測(cè)的熒光原位雜交(flurescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)和檢測(cè)蛋白過表達(dá)的免疫組化染色(immuno-histochemistry，IHC)兩種。胃癌中HER2陽性率報(bào)道從6%～35%不等[14-16]，造成這種結(jié)果的原因可能有種族不同，樣本量過小，非標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)的使用等因素。還可能因?yàn)镕ISH和IHC法檢測(cè)HER2為定性檢查，檢測(cè)者主觀判定不一，而且從獲取腫瘤組織到判讀的整個(gè)流程繁瑣，影響HER2檢測(cè)結(jié)果的因素非常多，稍有疏漏都有可能影響最終的結(jié)果。

更為重要的是，IHC 和FISH法取材困難，研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)血清ctDNA可以實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤基因組信息,被稱為“液體活檢”。ctDNA是雙鏈DNA片段,主要來源于凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞，增殖活躍的腫瘤細(xì)胞能主動(dòng)釋放DNA片段到外周循環(huán)中[17]。研究證實(shí)腫瘤患者ctDNA所攜帶的腫瘤基因組信息與腫瘤組織具有良好的一致性，能克服常規(guī)腫瘤組織活檢所無法突破的腫瘤異質(zhì)性問題[18]。通過對(duì)外周循環(huán)樣本進(jìn)行ctDNA檢測(cè)，能協(xié)助早期診斷、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷，也有助于靶向治療適應(yīng)癥的評(píng)估，從而推進(jìn)精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施。

微滴數(shù)字PCR是ctDNA突變定量檢測(cè)的優(yōu)選檢測(cè)手段，可通過單分子擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)核酸拷貝數(shù)絕對(duì)定量，是一種高靈敏度的PCR定量檢測(cè)技術(shù)[19]，目前已被廣泛應(yīng)用到醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等方面，如拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等，并且在癌癥分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、傳染病研究、基因組結(jié)構(gòu)變異分析、基因表達(dá)分析等領(lǐng)域展現(xiàn)了強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。本研究采用ddPCR技術(shù)，檢測(cè)胃癌患者血清ctDNA中HER2基因擴(kuò)增表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)本組患者ddPCR的基因擴(kuò)增與ICH的符合率為96%(96/100)，證實(shí)外周血ctDNA基因信息與腫瘤組織一致。同時(shí)，HER2陽性組預(yù)后不良率顯著高于HER2陰性組，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明ctDNA中HER2與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)。

總體而言，微滴數(shù)字PCR檢測(cè)ctDNA中HER2表達(dá)，能夠提供實(shí)時(shí)的腫瘤負(fù)荷進(jìn)展監(jiān)測(cè)，對(duì)腫瘤診斷、療效評(píng)估、預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向藥物篩查均具有一定價(jià)值。