微粒子化學(xué)發(fā)光檢測體系的研發(fā)介紹

孫梅 劉鵬 耿建利 王曉偉 姚繼承 王明義

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院中心實驗室，山東威海 264200；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬威海市立醫(yī)院肝膽外科，山東威海 264200；3.威海威高生物科技有限公司，山東威海 264200

化學(xué)發(fā)光免疫檢測法是目前檢測抗原、半抗原及抗體的主流方式，靈敏度、特異性高的特點使其可用于腫瘤標志物、激素等微量物質(zhì)的超微定量及定性分析。因此，在各級醫(yī)療機構(gòu)中全自動化學(xué)發(fā)光檢測儀應(yīng)用普遍。實驗室對全自動化學(xué)發(fā)光檢測儀的臨床性能要求也不斷提高?；瘜W(xué)發(fā)光體系的設(shè)計與應(yīng)用是發(fā)展化學(xué)發(fā)光技術(shù)的前提。國外對于化學(xué)發(fā)光體系的研究與應(yīng)用已經(jīng)相當(dāng)成熟，通過實現(xiàn)與高效液相 色譜、毛細管電泳、生化免疫分析、電化學(xué)分析等技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用可解決化學(xué)發(fā)光分析固有選擇性差這一難題，使化學(xué)發(fā)光分析靈敏度更高、結(jié)果更準確。但我國國產(chǎn)儀器與國外同類產(chǎn)品在性能上還有一定差距，因此，提高核心科學(xué)技術(shù)的整體水平而推動國內(nèi)自動化儀器的發(fā)展是必然趨勢。微粒子化學(xué)發(fā)光檢測體系作為化學(xué)發(fā)光檢測儀的重要模塊，其關(guān)鍵技術(shù)水平也在不斷優(yōu)化。本文以新一代國產(chǎn)免疫分析儀AutolumiS 3000的微粒子化學(xué)發(fā)光檢測體系為例，對微粒子化學(xué)發(fā)光檢測體系進行介紹。

化學(xué)發(fā)光試劑的研究應(yīng)用及發(fā)展是推動化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)進步的基礎(chǔ)。目前化學(xué)發(fā)光試劑的種類有很多，包括魯米諾類、吖啶酯類、過氧草酸酯類和1，2-二氧雜環(huán)丁烷類等，魯米諾類發(fā)光效率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且無毒的特點使其成為化學(xué)發(fā)光試劑的代表性物質(zhì)之一，在免疫分析或非免疫分析診斷、檢測技術(shù)和生物傳感器等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

1 免疫復(fù)合物形成

魯米諾類是目前化學(xué)發(fā)光體系中應(yīng)用最為廣泛的化學(xué)發(fā)光試劑。異魯米諾發(fā)光效率雖較魯米諾差，但異魯米諾做為一種標記物,被標記到抗原或抗體上時,它的發(fā)光效率則顯著增加。結(jié)合異魯米諾反應(yīng)時間短、背景噪聲低、可直接標記抗原或抗體且結(jié)合穩(wěn)定的特點，AutolumiS 3000的微粒子化學(xué)發(fā)光檢測體系選用異魯米諾作為直接發(fā)光試劑。在免疫反應(yīng)過程中，以抗原或抗體異魯米諾發(fā)光標記物為示蹤信號，以偶聯(lián)抗原或抗體的磁性微粒子為載體，增大反應(yīng)表面積，與待測物在均相中反應(yīng)，形成“夾心”免疫復(fù)合物。

2 免疫復(fù)合物無損磁性分離

2.1 微米級別的磁性微粒

AutolumiS 3000的微粒子化學(xué)發(fā)光檢測體系采用微米級別的Fe3O4核心的磁微粒為固相載體—磁性微粒表面積大，蛋白吸附能力極強，與包被管或包被珠相比反應(yīng)表面積增大50倍，是目前最理想的免疫固相分離載體之一。磁微粒增進了結(jié)合動力并保證了較大的敏感度。分散懸浮液的反應(yīng)速率接近均相溶液的動力學(xué)，同時抗原抗體的相對反應(yīng)濃度增高，增快了捕捉的有效性，提高了精確度，加快了免疫反應(yīng)的速度。

圖2 儀器洗滌區(qū)磁分離結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 磁場磁性分離技術(shù)

通過對復(fù)合物顆粒磁分離過程的分析，給出了磁場設(shè)計原則（按圖1從小到大依次為16S、15N、14S、13N…順序排列）。免疫復(fù)合物充分無損分離技術(shù)（磁場磁性分離技術(shù)）的分離共分為三個過程，即吸附過程、沖洗過程和吸走過程。磁鐵吸附住磁微粒，能更有效的將游離相和結(jié)合相分離。將未結(jié)合的抗原和標記物洗滌清除，實現(xiàn)了免疫復(fù)合物顆粒快速充分無損分離。

AutolumiS 3000儀器磁分離模塊結(jié)構(gòu)示意圖（如圖2）。磁場作用原理：反應(yīng)杯中的免疫復(fù)合物所處的環(huán)境可以視為磁流體，在外加磁場的作用下，液體中的免疫復(fù)合物被磁化靠近永磁體，吸附在反應(yīng)杯壁上，而未與發(fā)光標記物結(jié)合的顆粒則仍然在反應(yīng)杯中間位置通過沖洗過程和吸走過程，只留下結(jié)合的免疫復(fù)合物，從而實現(xiàn)復(fù)合物顆粒磁分離過程。

磁場的作用是將復(fù)合顆粒束縛在反應(yīng)杯中，但是又不能使復(fù)合物聚集結(jié)團，為避免這一情況發(fā)生采用圓形的磁鐵。在磁分離過程中，外加磁場位于反應(yīng)器皿的側(cè)面吸附前復(fù)合物顆粒均勻分散在反應(yīng)杯中，吸附后附著在反應(yīng)杯的側(cè)壁，反應(yīng)杯吸附過程如圖3所示。

圖3 反應(yīng)杯吸附過程示意圖

3 異魯米諾化學(xué)發(fā)光

異魯米諾化學(xué)發(fā)光已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、生命科學(xué)等領(lǐng)域中有機物及無機物的檢測。其發(fā)光機理是在堿性環(huán)境中下，異魯米諾被氧化劑H2O2氧化而處于激發(fā)態(tài)，當(dāng)其返回到基態(tài)過程中發(fā)出光子，從而獲得閃光信號，如圖4所示。為保證反應(yīng)充分徹底，使測量結(jié)果準確可靠，必須實現(xiàn)全部復(fù)合物顆粒與激發(fā)液的充分接觸。因此，通過直針與彎針形式的洗滌針（如圖5所示），在激發(fā)液加注前的洗滌過程中通過直針將反應(yīng)杯底部的復(fù)合物顆粒團沖開，彎針將貼附在杯壁上的復(fù)合物顆粒沖下，防止復(fù)合物顆粒聚集成團，保證未結(jié)合顆粒全部吸走。

圖4 異魯米諾化學(xué)發(fā)光原理圖

圖5 洗滌針中直針、彎針設(shè)計

4 微弱閃光信號精確測量

為實現(xiàn)信號的精確測量，研制出微弱閃光信號精確測量技術(shù)系統(tǒng)，AutolumiS 3000測量室結(jié)構(gòu)如圖6所示。該系統(tǒng)設(shè)有嚴格避光的暗室環(huán)境（如圖7所示）。反應(yīng)杯進入反應(yīng)杯通道，傳送到反應(yīng)杯第一孔加注激發(fā)液位置，擋光板關(guān)閉，通過測量室升降動作，控制玻璃關(guān)門打開，加注激發(fā)液并測量反應(yīng)杯第一孔。然后玻璃關(guān)門關(guān)閉，傳到第二孔加注激發(fā)液位置，依次進行。暗室采用背膠毛氈等材料實現(xiàn)加注針移動過程中的動密封，同時采用交替遮擋方法實現(xiàn)測量室的光密封，能有效去除背景光反射，降低本底噪聲，使測量更精準?；瘜W(xué)反應(yīng)所產(chǎn)生的閃光信號通過集光器接收，并在光電倍增管作用下實現(xiàn)信號的放大，通過上位機處理程序分析所得RLU值（relative light unit），獲得樣本濃度信息，實現(xiàn)待測物的定量或定性分析。

圖6 發(fā)光檢測系統(tǒng)測量室結(jié)構(gòu)圖

圖7 測量室暗室環(huán)境示意圖

5 小結(jié)

AutolumiS 3000微粒子化學(xué)發(fā)光體系采用異魯米諾為化學(xué)發(fā)光劑，可通過反應(yīng)中化合物能量的躍遷產(chǎn)生光量子而獲得樣本的濃度信息，不需要增加外部光源，從而減少了瑞利散射和拉曼散射，背景光信號干擾小，使測量結(jié)果更加精準。在免疫反應(yīng)中采用磁性微粒為載體，與包被管、包被珠相比，反應(yīng)表面積增大了50倍，可大幅度縮短檢測時間，且在磁場作用下可有效實現(xiàn)結(jié)合相與游離相的充分無損分離?？朔藗鹘y(tǒng)酶免疫方法反應(yīng)時間長、操作繁瑣、靈敏度低等缺點。該體系中還設(shè)有微弱閃光信號檢測系統(tǒng)，在完全密閉的暗室中完成化學(xué)發(fā)光反應(yīng)及閃光信號的收集，消除背景光干擾，從而實現(xiàn)待測物濃度信息準確分析。