• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合乳膠微球試紙條快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌

    2019-12-26 06:14:34高建欣藏雨軒杜欣軍李碩
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:乳膠恒溫菌液

    高建欣藏雨軒杜欣軍李碩

    (1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457;2.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300071)

    金黃色葡萄球菌是一種重要的食源性致病菌,廣泛存在于自然界中,在食品加工過(guò)程中被金黃色葡萄球菌污染的食品,經(jīng)食用后會(huì)引起食物中毒,這是由于金黃色葡萄球菌可分泌腸毒素和表皮剝落毒素等多種毒素[1]。在我國(guó)由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的四分之一[2],給食品安全帶來(lái)巨大隱患。目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定[3]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的檢測(cè)方法[4]。分離鑒定成本低,但操作繁瑣且耗時(shí);PCR需要經(jīng)歷變性-退火-延伸等熱循環(huán)過(guò)程,依賴(lài)于昂貴儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)員,難以在基層及偏遠(yuǎn)地區(qū)廣泛應(yīng)用。因此迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

    近年來(lái),恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于可以在某一特定溫度進(jìn)行核酸擴(kuò)增而備受青睞,主要包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、鏈置換恒溫?cái)U(kuò)增(strand displacement amplification,SDA)、滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)、依賴(lài)解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增(helicase-dependent amplification,HDA)和重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)等[5]。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法和PCR的缺陷,實(shí)現(xiàn)了快速和準(zhǔn)確檢測(cè),尤其是在缺乏完備實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的情況下。RPA作為一種新型恒溫快速擴(kuò)增核酸的方法,與常見(jiàn)PCR不同,RPA可以在單一恒定溫度下(37℃~42℃)快速擴(kuò)增DNA,在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)就可完成檢測(cè)[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光或試紙條等檢測(cè)。其中,凝膠電泳操作耗時(shí)[7];實(shí)時(shí)熒光需借助大型儀器,價(jià)格昂貴[8];而試紙條不僅制備簡(jiǎn)單,且不需其他設(shè)備輔助,只需5min~10 min即可得到結(jié)果[9]。試紙條有許多標(biāo)記物,如膠體金、膠體碳、量子點(diǎn)、彩色乳膠微球等[10]。彩色聚苯乙烯乳膠微球是強(qiáng)疏水性的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物,微球的粒徑分布均一、穩(wěn)定性好,在合成乳膠過(guò)程中通過(guò)加入不同顏色染料可形成多種顏色微球,且顏色穩(wěn)定不易脫落,可以在一根試紙條上檢測(cè)多種不同物質(zhì),每種物質(zhì)分別代表不同顏色,彌補(bǔ)了其他標(biāo)記物在多重檢測(cè)產(chǎn)生顏色混淆的不足[11]。

    金黃色葡萄球菌作為一種重要的食源性致病菌,已成為世界多數(shù)國(guó)家進(jìn)出口食品法定檢驗(yàn)檢疫的致病菌之一[12],因而建立快速有效的方法對(duì)預(yù)防金黃色葡萄球菌的感染具有重要意義。檢測(cè)金黃色葡萄球菌常規(guī)方法是基于微生物方法,但耗時(shí)耗力,操作繁瑣,不適合快速檢測(cè);另外常見(jiàn)方法是基于PCR的分子生物學(xué)方法,如PCR,real-time qPCR和巢式PCR等,然而此類(lèi)方法均需要昂貴精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用[13]。本研究將RPA和乳膠微球試紙條(latex microsphere test strips,LMTS)結(jié)合,可以快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌,同時(shí)具有高靈敏度和良好的特異性,為食品安全相關(guān)領(lǐng)域的快速檢測(cè)提供新的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與材料

    金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌:天津科技大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室;酵母粉和蛋白胨:青島海博生物公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒:北京天根生物有限公司;RPA kit:英國(guó)Twist DX公司;乳膠微球:天津大鵝科技有限公司;LB 培養(yǎng)基(luria-bertani,LB):北京陸橋技術(shù)股份有限公司;1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、2-N-嗎啡啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG 20000)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、磷酸緩沖鹽(phosphate buffer,PB)、磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution,PBST)、鏈霉親和素、羊抗鼠二抗:美國(guó)Sigma公司;鼠抗地高辛抗體:美國(guó)Abcam公司;試驗(yàn)用水均為超純水。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    Milli-Q超純水系統(tǒng)、Milipore HF 90 s硝酸纖維素膜:美國(guó)Millipore公司;HFU 586超低溫冰箱:美國(guó)Thermo公司;5415R小型高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司;SY-1-2電熱恒溫水浴鍋:天津歐諾儀器儀表有限公司;HVA-85高壓滅菌器:日本Hirayama公司;DYY-7C核酸電泳儀、Gel Doc 2000凝膠成像儀:美國(guó)Bio-Rad公司;MS3周轉(zhuǎn)式振搖器:德國(guó)IKA公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

    NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)獲得金黃色葡萄球菌nuc基因序列(GenBank:EF529607.1),應(yīng)用 primer 5.0設(shè)計(jì)引物,同時(shí)上游引物5'端標(biāo)記地高辛,下游引物5'端標(biāo)記生物素,引物由蘇州金唯智公司合成。

    上游引物:5'digoxin-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3';

    下 游 引 物 :5'biotin-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3'。

    1.2.2 活化和免疫乳膠微球

    取 400 μL 乳膠微球溶于 600 μL MES(0.1 mol/L,pH 7.4),加入 20 μL NHS(5 mg/L),充分混勻振蕩,超聲處理2 min,成功活化微球。向活化好的微球中加入15 μL用PB稀釋的抗地高辛抗體(1 mg/mL),4℃靜置孵育2 h,孵育結(jié)束后加入20%BSA和PEG 20000,4℃靜置孵育30 min進(jìn)行封閉。然后4℃條件下 14 000 r/min離心15 min,棄上清,用100 μL金標(biāo)工作液重懸沉淀,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌

    RPA 反應(yīng)體系為 50 μL,其中,2.4 μL 上下游引物(10 μmol/L),29.5 μL 緩沖液,2 μLDNA 模板和 11.2 μL ddH2O,然后加入freeze-dried酶,充分振蕩混勻,最后加入2.5 μL的280 nmol/L MgAc,將反應(yīng)管置于40℃水浴鍋反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物與2 μL免疫微球混合,然后加入90 μL PBST緩沖液,混勻后滴加在試紙條的加樣孔,5 min后觀察結(jié)果。

    1.2.4 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度

    將金黃色葡萄球菌DNA系列稀釋為5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg 和 5 fg,RPA 擴(kuò)增后取 100 μL產(chǎn)物加到試紙條樣品孔中,再加入3.5 μL包被抗體的微球,充分混勻,滴加到試紙條樣品墊上,5 min后觀察結(jié)果。取100 μL金黃色葡萄球菌加入含有10 mL LB培養(yǎng)液中,37℃,200 r/min搖床培養(yǎng)8 h,取出后用0.9%NaCl溶液1∶10梯度稀釋加入平板計(jì)數(shù)瓊脂中,第2天進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。再準(zhǔn)備金黃色葡萄球菌純菌液依次稀釋為 1.2×107、1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、1.2×101CFU/mL 和 1.2×100CFU/mL,使用水煮法提取基因組DNA,即取1 mL菌液置于99℃條件下裂解10 min,后迅速置于冰上冷卻10 min,最后10 000 r/min離心5 min,取上清即為DNA。用RPA最佳體系進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后100 μL混合物滴加在試紙條樣品孔中,室溫靜置5 min后觀察結(jié)果。

    1.2.5 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異性

    提取金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌DNA進(jìn)行RPA-LMTS特異性驗(yàn)證。上述試驗(yàn)菌株DNA作為試驗(yàn)?zāi)0澹紫冗M(jìn)行RPA擴(kuò)增,然后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用PBST稀釋至100 μL,再加入3.5 μL包被抗體的彩色乳膠微球,充分混勻,滴加到試紙條樣品墊上,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,5 min后觀察檢測(cè)結(jié)果。

    1.2.6 RPA-LMTS檢測(cè)實(shí)際樣品

    通過(guò)GB 4789.10-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》鑒定樣品中是否含金黃色葡萄球菌。分別稱(chēng)取25 g(mL)的雞肉、豬肉和牛奶,向其中分別添加1.2×100CFU/g(mL)的金黃色葡萄球菌純菌液。將被人工污染的金黃色葡萄球菌樣品加入到含有225 mL的7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)0、1、2、3、4小時(shí)后采集培養(yǎng)物,應(yīng)用水煮法提取基因組DNA,作為RPA體系的模板。應(yīng)用RPA最佳體系進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后將100 μL混合物加到試紙條樣品孔中,5 min后觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 靈敏度分析

    靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度Fig.1 Sensitivity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

    金黃色葡萄球菌不同濃度DNA為模板進(jìn)行RPA試驗(yàn),產(chǎn)物用微球試紙條檢測(cè),如圖1a所示,檢測(cè)限為500 fg DNA。為確定RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌液的檢測(cè)限,將金黃色葡萄球菌純菌液從1.2×106CFU/mL 10倍梯度依次稀釋至1.2×100CFU/mL。如圖1b所示,隨著金黃色葡萄球菌的濃度增加,檢測(cè)線亮度逐漸增加,當(dāng)濃度為1.2×101CFU/mL時(shí),檢測(cè)線亮度與陰性對(duì)照有明顯不同。因此,濃度為1.2×101CFU/mL是檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌液的檢測(cè)限。

    2.2 特異性分析

    特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

    選擇金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌驗(yàn)證RPALMTS特異性,結(jié)果顯示只有金黃色葡萄球菌出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測(cè)線,而非金黃色葡萄球菌只有一條質(zhì)控線。結(jié)果說(shuō)明RPA-LMTS特異性良好,不會(huì)與其他菌株發(fā)生交叉反應(yīng)。

    圖2 RPA-LMTS對(duì)金黃色葡萄球菌特異性Fig.2 Specificity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

    2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)分析

    為驗(yàn)證RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的實(shí)用性,選擇牛肉、雞肉和牛奶為待測(cè)實(shí)際樣品,分別接種1.2×100CFU/mL(g)金黃色葡萄球菌,37℃增菌不同時(shí)間后收集提取DNA進(jìn)行RPA-LMTS檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示1.2×100CFU/mL(g)金黃色葡萄球菌在牛肉、雞肉和牛奶中增菌3小時(shí)后可被檢測(cè)出。

    圖3 金黃色葡萄球菌增菌不同時(shí)間RPA-LMTS檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection of S.aureus in simulated food samples by RPALMTS after incubation for different times

    3 討論

    近年來(lái),像LAMP[14],依賴(lài)HDA[15]和RPA等多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于擴(kuò)增核酸。LAMP是基于Bst DNA聚合酶進(jìn)行鏈置換和DNA合成,LAMP可以在60 min內(nèi),60℃~65℃條件下進(jìn)行DNA擴(kuò)增[16]。然而LAMP需要4~6對(duì)的引物,且需要跨越6個(gè)不同的靶序列,引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。HDA是利用DNA解旋酶打開(kāi)雙鏈DNA,并產(chǎn)生單鏈模板用于引物雜交和擴(kuò)增。使用解旋酶消除了對(duì)復(fù)雜加熱設(shè)備的需求,使反應(yīng)能在較低的溫度下進(jìn)行。但在進(jìn)行HDA前通常需要優(yōu)化試驗(yàn)條件,如緩沖液組成和反應(yīng)溫度等,增加試驗(yàn)成本[5]。與以上相比,本研究通過(guò)建立了RPA-LMTS快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌,RPA可在40℃條件下擴(kuò)增金黃色葡萄球菌,大大降低對(duì)試驗(yàn)設(shè)備的要求。

    RPA是目前最快的核酸擴(kuò)增技術(shù)之一,20 min內(nèi)即可完成檢測(cè),RPA主要依賴(lài)于三種酶:重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白酶和鏈置換DNA聚合酶。在RPA反應(yīng)中,重組酶先與引物形成復(fù)合物,重組酶-引物復(fù)合物再與靶目標(biāo)結(jié)合,然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增[17]。RPA還具有以下優(yōu)勢(shì):第一,可以在相對(duì)較低的溫度下(37℃~42℃)反應(yīng)[18];第二,如果樣品中含有某些雜質(zhì)也不會(huì)影響RPA,可省去DNA純化過(guò)程,更加便捷和快速[19];第三,RPA體系中的酶呈凍干態(tài),運(yùn)輸時(shí)不需冷藏,更加便于運(yùn)輸。當(dāng)本研究使RPA與LMTS的結(jié)合后檢測(cè)更加快速,同時(shí)靈敏度提高。RPA-LMTS僅需15 min即可獲得結(jié)果(包括10 min擴(kuò)增和5 min檢測(cè)),檢測(cè)限為500 fg DNA和1.2×101CFU/mL純菌液,且與非金黃色葡萄球菌無(wú)交叉反應(yīng),當(dāng)實(shí)際樣品污染量為1.2×100CFU/mL(g)金黃色葡萄球菌時(shí),可在3.5 h內(nèi)完成檢測(cè)。RPA-LMTS可應(yīng)用于在基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

    猜你喜歡
    乳膠恒溫菌液
    洗乳膠枕 先浸泡后按壓
    多糖微生物菌液對(duì)油菜吸收養(yǎng)分和土壤氮磷淋失的影響
    四步挑選乳膠枕
    基于PLC及組態(tài)技術(shù)的恒溫控制系統(tǒng)開(kāi)發(fā)探討
    Bonfire Night
    基于PID控制的一體化恒溫激光器系統(tǒng)設(shè)計(jì)
    鼠傷寒沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中通過(guò)吸光度值測(cè)定菌液濃度的方法研究
    理想氣體恒溫可逆和絕熱可逆過(guò)程功的比較與應(yīng)用
    如何選購(gòu)保養(yǎng)乳膠枕
    益壽寶典(2017年11期)2017-02-26 18:38:12
    基于單片機(jī)的恒溫自動(dòng)控制系統(tǒng)
    電子制作(2017年24期)2017-02-02 07:14:16
    在线观看日韩欧美| 男女高潮啪啪啪动态图| 91在线观看av| 久久婷婷成人综合色麻豆| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 人人妻人人澡人人看| 久久影院123| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 欧美激情 高清一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av| 少妇的丰满在线观看| 真人做人爱边吃奶动态| 国产高清视频在线播放一区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 制服诱惑二区| 午夜久久久在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 天堂√8在线中文| 国产精品 国内视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 色婷婷久久久亚洲欧美| 好男人电影高清在线观看| 一进一出好大好爽视频| 中亚洲国语对白在线视频| 精品欧美一区二区三区在线| 欧美日韩av久久| 免费少妇av软件| 啦啦啦在线免费观看视频4| 动漫黄色视频在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产成人精品久久二区二区免费| 身体一侧抽搐| 亚洲av成人av| 波多野结衣一区麻豆| 精品久久久久久成人av| 在线观看66精品国产| 久久狼人影院| 免费看十八禁软件| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美成人午夜精品| 国产精品二区激情视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲av成人一区二区三| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久久国产精品麻豆| 国产熟女午夜一区二区三区| 两个人看的免费小视频| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 黄色女人牲交| a级毛片在线看网站| 国产亚洲欧美精品永久| 一级黄色大片毛片| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产精品国产高清国产av| 成人三级黄色视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产激情久久老熟女| 热99国产精品久久久久久7| 久久久国产欧美日韩av| 精品福利永久在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲人成77777在线视频| 日本一区二区免费在线视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 色综合站精品国产| 女人被狂操c到高潮| 精品久久久精品久久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 亚洲人成电影观看| 丁香六月欧美| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品免费视频内射| 十八禁网站免费在线| 99香蕉大伊视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产成人精品在线电影| 69精品国产乱码久久久| 国产片内射在线| 亚洲五月色婷婷综合| 精品一品国产午夜福利视频| 十八禁人妻一区二区| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 曰老女人黄片| 午夜免费观看网址| 一进一出抽搐动态| 无限看片的www在线观看| 日本欧美视频一区| 亚洲一区二区三区欧美精品| 精品国产乱子伦一区二区三区| 麻豆久久精品国产亚洲av | 午夜91福利影院| 午夜影院日韩av| 午夜亚洲福利在线播放| 高清在线国产一区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 香蕉丝袜av| 大码成人一级视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜a级毛片| 久久精品91无色码中文字幕| 免费观看精品视频网站| 久久人人精品亚洲av| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产91精品成人一区二区三区| 99riav亚洲国产免费| 久久久久久久久免费视频了| av中文乱码字幕在线| 一夜夜www| www.精华液| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 宅男免费午夜| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲自拍偷在线| 欧美激情高清一区二区三区| 精品久久久久久成人av| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 久久香蕉精品热| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费不卡黄色视频| 一级毛片女人18水好多| 男人舔女人的私密视频| 天堂中文最新版在线下载| 国产av一区在线观看免费| 激情视频va一区二区三区| av在线播放免费不卡| 中亚洲国语对白在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| ponron亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲欧美激情综合另类| 少妇 在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩大码丰满熟妇| 午夜日韩欧美国产| 免费少妇av软件| 丝袜人妻中文字幕| 在线国产一区二区在线| 久久亚洲精品不卡| 香蕉国产在线看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲七黄色美女视频| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲欧美激情在线| 大陆偷拍与自拍| 高清av免费在线| 黄色成人免费大全| 一个人免费在线观看的高清视频| 99久久精品国产亚洲精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 99热只有精品国产| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 久久人妻av系列| 欧美日韩亚洲高清精品| 性色av乱码一区二区三区2| 99久久综合精品五月天人人| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 久久热在线av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 大型av网站在线播放| 精品第一国产精品| 精品一区二区三卡| av福利片在线| 在线观看66精品国产| 国产一区二区激情短视频| 久99久视频精品免费| 无限看片的www在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久久久久午夜电影 | 久久久久久人人人人人| 精品福利永久在线观看| 在线观看舔阴道视频| 99re在线观看精品视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 在线观看www视频免费| 国产午夜精品久久久久久| 性少妇av在线| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美日韩乱码在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 免费av毛片视频| bbb黄色大片| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 电影成人av| 国产成人av激情在线播放| 99久久人妻综合| 人成视频在线观看免费观看| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av成人av| 成人影院久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 免费观看人在逋| √禁漫天堂资源中文www| 18禁观看日本| www.www免费av| 热re99久久国产66热| 在线观看一区二区三区激情| 中文欧美无线码| 久久精品国产综合久久久| 久久久国产欧美日韩av| 成人手机av| 一本综合久久免费| 色综合站精品国产| 亚洲在线自拍视频| 国产高清激情床上av| 麻豆国产av国片精品| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 国产精品偷伦视频观看了| 韩国av一区二区三区四区| 免费在线观看完整版高清| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一级,二级,三级黄色视频| 一区二区三区国产精品乱码| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产激情久久老熟女| 乱人伦中国视频| 丝袜人妻中文字幕| 国产免费男女视频| 国产免费现黄频在线看| 中文字幕最新亚洲高清| 精品国产一区二区三区四区第35| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美日韩乱码在线| 精品国产国语对白av| 国产91精品成人一区二区三区| 久久久国产成人精品二区 | 成人国语在线视频| 好男人电影高清在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲色图综合在线观看| 黄片小视频在线播放| 中文字幕色久视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美乱妇无乱码| 色老头精品视频在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| www.精华液| 色在线成人网| 精品国产一区二区久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日韩av在线大香蕉| 国产成+人综合+亚洲专区| 十八禁网站免费在线| 男女高潮啪啪啪动态图| 日本 av在线| 极品人妻少妇av视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 咕卡用的链子| 亚洲中文av在线| 天堂影院成人在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| www国产在线视频色| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品91无色码中文字幕| 欧美日韩av久久| 香蕉丝袜av| 99国产精品99久久久久| 国产精品一区二区三区四区久久 | 免费搜索国产男女视频| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美中文综合在线视频| 国产又爽黄色视频| 中出人妻视频一区二区| 亚洲国产精品999在线| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 欧美日韩黄片免| 最近最新免费中文字幕在线| 热99国产精品久久久久久7| 淫秽高清视频在线观看| 免费在线观看日本一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 人人澡人人妻人| 一区二区日韩欧美中文字幕| 成人亚洲精品av一区二区 | 中文字幕最新亚洲高清| 国产欧美日韩一区二区三| 成年女人毛片免费观看观看9| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久精品亚洲av国产电影网| 日本黄色视频三级网站网址| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 成人手机av| 一级黄色大片毛片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | www.www免费av| 手机成人av网站| 大陆偷拍与自拍| 麻豆一二三区av精品| 久久天堂一区二区三区四区| 免费av中文字幕在线| 亚洲国产精品sss在线观看 | 国产一区二区三区视频了| 麻豆av在线久日| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产成人精品在线电影| netflix在线观看网站| 亚洲熟妇熟女久久| 免费观看精品视频网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 久久 成人 亚洲| 国产欧美日韩精品亚洲av| xxx96com| 丰满的人妻完整版| 国产精品 欧美亚洲| 国产不卡一卡二| 欧美一级毛片孕妇| 日韩欧美国产一区二区入口| 热99re8久久精品国产| 老熟妇仑乱视频hdxx| www.www免费av| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲国产精品sss在线观看 | 久久欧美精品欧美久久欧美| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 三级毛片av免费| 大型黄色视频在线免费观看| 操出白浆在线播放| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 无人区码免费观看不卡| 国产深夜福利视频在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 女人精品久久久久毛片| www.自偷自拍.com| 日韩有码中文字幕| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久这里只有精品19| 成人国产一区最新在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 日本 av在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜免费成人在线视频| 国产单亲对白刺激| 天天影视国产精品| 午夜成年电影在线免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 大陆偷拍与自拍| 91在线观看av| 一夜夜www| 国产精品乱码一区二三区的特点 | av网站在线播放免费| 波多野结衣高清无吗| 性色av乱码一区二区三区2| 超碰成人久久| 电影成人av| 少妇 在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 麻豆久久精品国产亚洲av | 国产又爽黄色视频| 多毛熟女@视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 国产成人精品久久二区二区免费| 国产精品av久久久久免费| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产成人精品无人区| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久99一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 精品福利永久在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 超色免费av| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 成人18禁在线播放| 88av欧美| 美女福利国产在线| 国产精品av久久久久免费| 中文字幕精品免费在线观看视频| 免费搜索国产男女视频| 一区二区三区激情视频| 香蕉国产在线看| 午夜视频精品福利| 精品久久久久久电影网| 国产成人系列免费观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产一卡二卡三卡精品| 亚洲色图综合在线观看| 国产av精品麻豆| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产精品久久电影中文字幕| 在线永久观看黄色视频| 亚洲情色 制服丝袜| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成人精品一区二区免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 成人永久免费在线观看视频| 国产成人精品无人区| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 怎么达到女性高潮| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 视频在线观看一区二区三区| 国产成人欧美| 国产麻豆69| 欧美av亚洲av综合av国产av| svipshipincom国产片| 国产欧美日韩一区二区三| 黄片播放在线免费| 国产精品九九99| 亚洲欧美一区二区三区久久| 黄频高清免费视频| 又紧又爽又黄一区二区| 久久九九热精品免费| 午夜精品国产一区二区电影| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 天天影视国产精品| 国产精品一区二区在线不卡| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲精品久久午夜乱码| 大陆偷拍与自拍| 亚洲国产精品合色在线| 一区二区三区精品91| 丝袜在线中文字幕| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 日本欧美视频一区| 久久热在线av| 午夜福利在线免费观看网站| 美女国产高潮福利片在线看| 久久九九热精品免费| 91字幕亚洲| 久久草成人影院| 国产精品国产av在线观看| 亚洲情色 制服丝袜| av有码第一页| 老司机亚洲免费影院| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲全国av大片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 多毛熟女@视频| 一区福利在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产黄a三级三级三级人| 国产亚洲精品一区二区www| 91av网站免费观看| 国产视频一区二区在线看| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲第一av免费看| 国产精品一区二区免费欧美| 嫩草影院精品99| 日韩免费高清中文字幕av| 日韩人妻精品一区2区三区| 欧美亚洲日本最大视频资源| x7x7x7水蜜桃| 日本欧美视频一区| 91老司机精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 手机成人av网站| 国产av又大| 91成人精品电影| 国产单亲对白刺激| 99热只有精品国产| 搡老熟女国产l中国老女人| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人av一区二区三区在线看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 丁香欧美五月| 中文字幕最新亚洲高清| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲色图av天堂| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 天堂影院成人在线观看| 露出奶头的视频| 女性被躁到高潮视频| 国产色视频综合| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 精品久久久久久成人av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩精品中文字幕看吧| 久9热在线精品视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 两个人免费观看高清视频| 精品久久久久久久久久免费视频 | 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产av精品麻豆| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲九九香蕉| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品国产一区二区久久| 黄色女人牲交| 亚洲av片天天在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲伊人色综图| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美色视频一区免费| 国产精品久久久av美女十八| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日本免费a在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 欧美在线黄色| 黄片播放在线免费| 日本免费a在线| 妹子高潮喷水视频| 精品欧美一区二区三区在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 日韩高清综合在线| 午夜影院日韩av| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产伦人伦偷精品视频| 精品国产亚洲在线| 国产亚洲欧美98| 久久天堂一区二区三区四区| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲人成电影观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久人妻av系列| 欧美激情高清一区二区三区| 国产99白浆流出| 中出人妻视频一区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美av亚洲av综合av国产av| xxxhd国产人妻xxx| 欧美在线一区亚洲| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品久久蜜臀av无| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲色图av天堂| 久久这里只有精品19| 1024香蕉在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 久久精品亚洲av国产电影网| 丁香欧美五月| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 久热爱精品视频在线9| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 亚洲激情在线av| 韩国av一区二区三区四区| 成人手机av| 午夜福利欧美成人| 一级毛片精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 色在线成人网| 国产99久久九九免费精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 91字幕亚洲| av天堂久久9| 俄罗斯特黄特色一大片| 色哟哟哟哟哟哟| 精品日产1卡2卡| 亚洲精品粉嫩美女一区| 少妇 在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 久久久水蜜桃国产精品网| 九色亚洲精品在线播放| 精品久久久久久电影网| 99精品欧美一区二区三区四区| 又黄又爽又免费观看的视频| 美女 人体艺术 gogo| 欧美午夜高清在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产不卡一卡二| 亚洲av成人一区二区三| 欧美精品一区二区免费开放| 男女下面进入的视频免费午夜 | 成人国语在线视频| 成年人免费黄色播放视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 黄色片一级片一级黄色片| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久热这里只有精品99| av电影中文网址| 99香蕉大伊视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 1024视频免费在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产99久久九九免费精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线观看一区二区三区激情| 一区二区三区国产精品乱码|