重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合乳膠微球試紙條快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌

高建欣藏雨軒杜欣軍李碩

（1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457；2.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300071）

金黃色葡萄球菌是一種重要的食源性致病菌，廣泛存在于自然界中，在食品加工過(guò)程中被金黃色葡萄球菌污染的食品，經(jīng)食用后會(huì)引起食物中毒，這是由于金黃色葡萄球菌可分泌腸毒素和表皮剝落毒素等多種毒素[1]。在我國(guó)由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的四分之一[2]，給食品安全帶來(lái)巨大隱患。目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定[3]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的檢測(cè)方法[4]。分離鑒定成本低，但操作繁瑣且耗時(shí)；PCR需要經(jīng)歷變性-退火-延伸等熱循環(huán)過(guò)程，依賴(lài)于昂貴儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)員，難以在基層及偏遠(yuǎn)地區(qū)廣泛應(yīng)用。因此迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

近年來(lái)，恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于可以在某一特定溫度進(jìn)行核酸擴(kuò)增而備受青睞，主要包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、鏈置換恒溫?cái)U(kuò)增（strand displacement amplification，SDA）、滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、依賴(lài)解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增（helicase-dependent amplification，HDA）和重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）等[5]。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法和PCR的缺陷，實(shí)現(xiàn)了快速和準(zhǔn)確檢測(cè)，尤其是在缺乏完備實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的情況下。RPA作為一種新型恒溫快速擴(kuò)增核酸的方法，與常見(jiàn)PCR不同，RPA可以在單一恒定溫度下（37℃～42℃）快速擴(kuò)增DNA，在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)就可完成檢測(cè)[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光或試紙條等檢測(cè)。其中，凝膠電泳操作耗時(shí)[7]；實(shí)時(shí)熒光需借助大型儀器，價(jià)格昂貴[8]；而試紙條不僅制備簡(jiǎn)單，且不需其他設(shè)備輔助，只需5min～10 min即可得到結(jié)果[9]。試紙條有許多標(biāo)記物，如膠體金、膠體碳、量子點(diǎn)、彩色乳膠微球等[10]。彩色聚苯乙烯乳膠微球是強(qiáng)疏水性的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物，微球的粒徑分布均一、穩(wěn)定性好，在合成乳膠過(guò)程中通過(guò)加入不同顏色染料可形成多種顏色微球，且顏色穩(wěn)定不易脫落，可以在一根試紙條上檢測(cè)多種不同物質(zhì)，每種物質(zhì)分別代表不同顏色，彌補(bǔ)了其他標(biāo)記物在多重檢測(cè)產(chǎn)生顏色混淆的不足[11]。

金黃色葡萄球菌作為一種重要的食源性致病菌，已成為世界多數(shù)國(guó)家進(jìn)出口食品法定檢驗(yàn)檢疫的致病菌之一[12]，因而建立快速有效的方法對(duì)預(yù)防金黃色葡萄球菌的感染具有重要意義。檢測(cè)金黃色葡萄球菌常規(guī)方法是基于微生物方法，但耗時(shí)耗力，操作繁瑣，不適合快速檢測(cè)；另外常見(jiàn)方法是基于PCR的分子生物學(xué)方法，如PCR，real-time qPCR和巢式PCR等，然而此類(lèi)方法均需要昂貴精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用[13]。本研究將RPA和乳膠微球試紙條（latex microsphere test strips，LMTS）結(jié)合，可以快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌，同時(shí)具有高靈敏度和良好的特異性，為食品安全相關(guān)領(lǐng)域的快速檢測(cè)提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與材料

金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌：天津科技大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室；酵母粉和蛋白胨：青島海博生物公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒：北京天根生物有限公司；RPA kit：英國(guó)Twist DX公司；乳膠微球：天津大鵝科技有限公司；LB 培養(yǎng)基（luria-bertani，LB）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、2-N-嗎啡啉乙磺酸（2-morpholinoethanesulfonic acid，MES）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG 20000）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、磷酸緩沖鹽（phosphate buffer，PB）、磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered solution，PBST）、鏈霉親和素、羊抗鼠二抗：美國(guó)Sigma公司；鼠抗地高辛抗體：美國(guó)Abcam公司；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)、Milipore HF 90 s硝酸纖維素膜：美國(guó)Millipore公司；HFU 586超低溫冰箱：美國(guó)Thermo公司；5415R小型高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；SY-1-2電熱恒溫水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；HVA-85高壓滅菌器：日本Hirayama公司；DYY-7C核酸電泳儀、Gel Doc 2000凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司；MS3周轉(zhuǎn)式振搖器：德國(guó)IKA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)獲得金黃色葡萄球菌nuc基因序列（GenBank：EF529607.1），應(yīng)用 primer 5.0設(shè)計(jì)引物，同時(shí)上游引物5'端標(biāo)記地高辛，下游引物5'端標(biāo)記生物素，引物由蘇州金唯智公司合成。

上游引物：5'digoxin-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3'；

下 游 引 物 ：5'biotin-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3'。

1.2.2 活化和免疫乳膠微球

取 400 μL 乳膠微球溶于 600 μL MES（0.1 mol/L，pH 7.4），加入 20 μL NHS（5 mg/L），充分混勻振蕩，超聲處理2 min，成功活化微球。向活化好的微球中加入15 μL用PB稀釋的抗地高辛抗體（1 mg/mL），4℃靜置孵育2 h，孵育結(jié)束后加入20%BSA和PEG 20000，4℃靜置孵育30 min進(jìn)行封閉。然后4℃條件下 14 000 r/min離心15 min，棄上清，用100 μL金標(biāo)工作液重懸沉淀，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌

RPA 反應(yīng)體系為 50 μL，其中，2.4 μL 上下游引物（10 μmol/L），29.5 μL 緩沖液，2 μLDNA 模板和 11.2 μL ddH2O，然后加入freeze-dried酶，充分振蕩混勻，最后加入2.5 μL的280 nmol/L MgAc，將反應(yīng)管置于40℃水浴鍋反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物與2 μL免疫微球混合，然后加入90 μL PBST緩沖液，混勻后滴加在試紙條的加樣孔，5 min后觀察結(jié)果。

1.2.4 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度

將金黃色葡萄球菌DNA系列稀釋為5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg 和 5 fg，RPA 擴(kuò)增后取 100 μL產(chǎn)物加到試紙條樣品孔中，再加入3.5 μL包被抗體的微球，充分混勻，滴加到試紙條樣品墊上，5 min后觀察結(jié)果。取100 μL金黃色葡萄球菌加入含有10 mL LB培養(yǎng)液中，37℃，200 r/min搖床培養(yǎng)8 h，取出后用0.9%NaCl溶液1∶10梯度稀釋加入平板計(jì)數(shù)瓊脂中，第2天進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。再準(zhǔn)備金黃色葡萄球菌純菌液依次稀釋為 1.2×107、1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、1.2×101CFU/mL 和 1.2×100CFU/mL，使用水煮法提取基因組DNA，即取1 mL菌液置于99℃條件下裂解10 min，后迅速置于冰上冷卻10 min，最后10 000 r/min離心5 min，取上清即為DNA。用RPA最佳體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后100 μL混合物滴加在試紙條樣品孔中，室溫靜置5 min后觀察結(jié)果。

1.2.5 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異性

提取金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌DNA進(jìn)行RPA-LMTS特異性驗(yàn)證。上述試驗(yàn)菌株DNA作為試驗(yàn)?zāi)０澹紫冗M(jìn)行RPA擴(kuò)增，然后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用PBST稀釋至100 μL，再加入3.5 μL包被抗體的彩色乳膠微球，充分混勻，滴加到試紙條樣品墊上，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，5 min后觀察檢測(cè)結(jié)果。

1.2.6 RPA-LMTS檢測(cè)實(shí)際樣品

通過(guò)GB 4789.10-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》鑒定樣品中是否含金黃色葡萄球菌。分別稱(chēng)取25 g（mL）的雞肉、豬肉和牛奶，向其中分別添加1.2×100CFU/g（mL）的金黃色葡萄球菌純菌液。將被人工污染的金黃色葡萄球菌樣品加入到含有225 mL的7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)0、1、2、3、4小時(shí)后采集培養(yǎng)物，應(yīng)用水煮法提取基因組DNA，作為RPA體系的模板。應(yīng)用RPA最佳體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后將100 μL混合物加到試紙條樣品孔中，5 min后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度分析

靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度Fig.1 Sensitivity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

金黃色葡萄球菌不同濃度DNA為模板進(jìn)行RPA試驗(yàn)，產(chǎn)物用微球試紙條檢測(cè)，如圖1a所示，檢測(cè)限為500 fg DNA。為確定RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌液的檢測(cè)限，將金黃色葡萄球菌純菌液從1.2×106CFU/mL 10倍梯度依次稀釋至1.2×100CFU/mL。如圖1b所示，隨著金黃色葡萄球菌的濃度增加，檢測(cè)線亮度逐漸增加，當(dāng)濃度為1.2×101CFU/mL時(shí)，檢測(cè)線亮度與陰性對(duì)照有明顯不同。因此，濃度為1.2×101CFU/mL是檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌液的檢測(cè)限。

2.2 特異性分析

特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

選擇金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌驗(yàn)證RPALMTS特異性，結(jié)果顯示只有金黃色葡萄球菌出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測(cè)線，而非金黃色葡萄球菌只有一條質(zhì)控線。結(jié)果說(shuō)明RPA-LMTS特異性良好，不會(huì)與其他菌株發(fā)生交叉反應(yīng)。

圖2 RPA-LMTS對(duì)金黃色葡萄球菌特異性Fig.2 Specificity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)分析

為驗(yàn)證RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的實(shí)用性，選擇牛肉、雞肉和牛奶為待測(cè)實(shí)際樣品，分別接種1.2×100CFU/mL（g）金黃色葡萄球菌，37℃增菌不同時(shí)間后收集提取DNA進(jìn)行RPA-LMTS檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示1.2×100CFU/mL（g）金黃色葡萄球菌在牛肉、雞肉和牛奶中增菌3小時(shí)后可被檢測(cè)出。

圖3 金黃色葡萄球菌增菌不同時(shí)間RPA-LMTS檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection of S.aureus in simulated food samples by RPALMTS after incubation for different times

3 討論

近年來(lái)，像LAMP[14]，依賴(lài)HDA[15]和RPA等多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于擴(kuò)增核酸。LAMP是基于Bst DNA聚合酶進(jìn)行鏈置換和DNA合成，LAMP可以在60 min內(nèi)，60℃～65℃條件下進(jìn)行DNA擴(kuò)增[16]。然而LAMP需要4～6對(duì)的引物，且需要跨越6個(gè)不同的靶序列，引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。HDA是利用DNA解旋酶打開(kāi)雙鏈DNA，并產(chǎn)生單鏈模板用于引物雜交和擴(kuò)增。使用解旋酶消除了對(duì)復(fù)雜加熱設(shè)備的需求，使反應(yīng)能在較低的溫度下進(jìn)行。但在進(jìn)行HDA前通常需要優(yōu)化試驗(yàn)條件，如緩沖液組成和反應(yīng)溫度等，增加試驗(yàn)成本[5]。與以上相比，本研究通過(guò)建立了RPA-LMTS快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌，RPA可在40℃條件下擴(kuò)增金黃色葡萄球菌，大大降低對(duì)試驗(yàn)設(shè)備的要求。

RPA是目前最快的核酸擴(kuò)增技術(shù)之一，20 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，RPA主要依賴(lài)于三種酶：重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白酶和鏈置換DNA聚合酶。在RPA反應(yīng)中，重組酶先與引物形成復(fù)合物，重組酶-引物復(fù)合物再與靶目標(biāo)結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增[17]。RPA還具有以下優(yōu)勢(shì)：第一，可以在相對(duì)較低的溫度下（37℃～42℃）反應(yīng)[18]；第二，如果樣品中含有某些雜質(zhì)也不會(huì)影響RPA，可省去DNA純化過(guò)程，更加便捷和快速[19]；第三，RPA體系中的酶呈凍干態(tài)，運(yùn)輸時(shí)不需冷藏，更加便于運(yùn)輸。當(dāng)本研究使RPA與LMTS的結(jié)合后檢測(cè)更加快速，同時(shí)靈敏度提高。RPA-LMTS僅需15 min即可獲得結(jié)果（包括10 min擴(kuò)增和5 min檢測(cè)），檢測(cè)限為500 fg DNA和1.2×101CFU/mL純菌液，且與非金黃色葡萄球菌無(wú)交叉反應(yīng)，當(dāng)實(shí)際樣品污染量為1.2×100CFU/mL（g）金黃色葡萄球菌時(shí)，可在3.5 h內(nèi)完成檢測(cè)。RPA-LMTS可應(yīng)用于在基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。