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    重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合乳膠微球試紙條快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌

    2019-12-26 06:14:34高建欣藏雨軒杜欣軍李碩
    食品研究與開(kāi)發(fā) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:乳膠恒溫菌液

    高建欣藏雨軒杜欣軍李碩

    (1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300457;2.南開(kāi)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,天津市食品科學(xué)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300071)

    金黃色葡萄球菌是一種重要的食源性致病菌,廣泛存在于自然界中,在食品加工過(guò)程中被金黃色葡萄球菌污染的食品,經(jīng)食用后會(huì)引起食物中毒,這是由于金黃色葡萄球菌可分泌腸毒素和表皮剝落毒素等多種毒素[1]。在我國(guó)由金黃色葡萄球菌所引起的食物中毒占細(xì)菌性食物中毒的四分之一[2],給食品安全帶來(lái)巨大隱患。目前檢測(cè)金黃色葡萄球菌方法主要有傳統(tǒng)分離鑒定[3]和基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的檢測(cè)方法[4]。分離鑒定成本低,但操作繁瑣且耗時(shí);PCR需要經(jīng)歷變性-退火-延伸等熱循環(huán)過(guò)程,依賴(lài)于昂貴儀器設(shè)備和專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)員,難以在基層及偏遠(yuǎn)地區(qū)廣泛應(yīng)用。因此迫切需要一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏的方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

    近年來(lái),恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)由于可以在某一特定溫度進(jìn)行核酸擴(kuò)增而備受青睞,主要包括環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、鏈置換恒溫?cái)U(kuò)增(strand displacement amplification,SDA)、滾環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)、依賴(lài)解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增(helicase-dependent amplification,HDA)和重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增(recombinase polymerase amplification,RPA)等[5]。恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法和PCR的缺陷,實(shí)現(xiàn)了快速和準(zhǔn)確檢測(cè),尤其是在缺乏完備實(shí)驗(yàn)室設(shè)施的情況下。RPA作為一種新型恒溫快速擴(kuò)增核酸的方法,與常見(jiàn)PCR不同,RPA可以在單一恒定溫度下(37℃~42℃)快速擴(kuò)增DNA,在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)就可完成檢測(cè)[6]。擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光或試紙條等檢測(cè)。其中,凝膠電泳操作耗時(shí)[7];實(shí)時(shí)熒光需借助大型儀器,價(jià)格昂貴[8];而試紙條不僅制備簡(jiǎn)單,且不需其他設(shè)備輔助,只需5min~10 min即可得到結(jié)果[9]。試紙條有許多標(biāo)記物,如膠體金、膠體碳、量子點(diǎn)、彩色乳膠微球等[10]。彩色聚苯乙烯乳膠微球是強(qiáng)疏水性的苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物,微球的粒徑分布均一、穩(wěn)定性好,在合成乳膠過(guò)程中通過(guò)加入不同顏色染料可形成多種顏色微球,且顏色穩(wěn)定不易脫落,可以在一根試紙條上檢測(cè)多種不同物質(zhì),每種物質(zhì)分別代表不同顏色,彌補(bǔ)了其他標(biāo)記物在多重檢測(cè)產(chǎn)生顏色混淆的不足[11]。

    金黃色葡萄球菌作為一種重要的食源性致病菌,已成為世界多數(shù)國(guó)家進(jìn)出口食品法定檢驗(yàn)檢疫的致病菌之一[12],因而建立快速有效的方法對(duì)預(yù)防金黃色葡萄球菌的感染具有重要意義。檢測(cè)金黃色葡萄球菌常規(guī)方法是基于微生物方法,但耗時(shí)耗力,操作繁瑣,不適合快速檢測(cè);另外常見(jiàn)方法是基于PCR的分子生物學(xué)方法,如PCR,real-time qPCR和巢式PCR等,然而此類(lèi)方法均需要昂貴精密的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的應(yīng)用[13]。本研究將RPA和乳膠微球試紙條(latex microsphere test strips,LMTS)結(jié)合,可以快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌,同時(shí)具有高靈敏度和良好的特異性,為食品安全相關(guān)領(lǐng)域的快速檢測(cè)提供新的方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試劑與材料

    金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌:天津科技大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室;酵母粉和蛋白胨:青島海博生物公司;細(xì)菌DNA提取試劑盒:北京天根生物有限公司;RPA kit:英國(guó)Twist DX公司;乳膠微球:天津大鵝科技有限公司;LB 培養(yǎng)基(luria-bertani,LB):北京陸橋技術(shù)股份有限公司;1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳酰二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、2-N-嗎啡啉乙磺酸(2-morpholinoethanesulfonic acid,MES)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG 20000)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)、磷酸緩沖鹽(phosphate buffer,PB)、磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered solution,PBST)、鏈霉親和素、羊抗鼠二抗:美國(guó)Sigma公司;鼠抗地高辛抗體:美國(guó)Abcam公司;試驗(yàn)用水均為超純水。

    1.1.2 儀器與設(shè)備

    Milli-Q超純水系統(tǒng)、Milipore HF 90 s硝酸纖維素膜:美國(guó)Millipore公司;HFU 586超低溫冰箱:美國(guó)Thermo公司;5415R小型高速冷凍離心機(jī):德國(guó)Eppendorf公司;SY-1-2電熱恒溫水浴鍋:天津歐諾儀器儀表有限公司;HVA-85高壓滅菌器:日本Hirayama公司;DYY-7C核酸電泳儀、Gel Doc 2000凝膠成像儀:美國(guó)Bio-Rad公司;MS3周轉(zhuǎn)式振搖器:德國(guó)IKA公司。

    1.2 方法

    1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成

    NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢(xún)獲得金黃色葡萄球菌nuc基因序列(GenBank:EF529607.1),應(yīng)用 primer 5.0設(shè)計(jì)引物,同時(shí)上游引物5'端標(biāo)記地高辛,下游引物5'端標(biāo)記生物素,引物由蘇州金唯智公司合成。

    上游引物:5'digoxin-GCATCACAAACAGATAACGGCGTAAATAGAAG-3';

    下 游 引 物 :5'biotin-ACATTAATTTAACCGTATCACCATCAATCGCT-3'。

    1.2.2 活化和免疫乳膠微球

    取 400 μL 乳膠微球溶于 600 μL MES(0.1 mol/L,pH 7.4),加入 20 μL NHS(5 mg/L),充分混勻振蕩,超聲處理2 min,成功活化微球。向活化好的微球中加入15 μL用PB稀釋的抗地高辛抗體(1 mg/mL),4℃靜置孵育2 h,孵育結(jié)束后加入20%BSA和PEG 20000,4℃靜置孵育30 min進(jìn)行封閉。然后4℃條件下 14 000 r/min離心15 min,棄上清,用100 μL金標(biāo)工作液重懸沉淀,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌

    RPA 反應(yīng)體系為 50 μL,其中,2.4 μL 上下游引物(10 μmol/L),29.5 μL 緩沖液,2 μLDNA 模板和 11.2 μL ddH2O,然后加入freeze-dried酶,充分振蕩混勻,最后加入2.5 μL的280 nmol/L MgAc,將反應(yīng)管置于40℃水浴鍋反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL產(chǎn)物與2 μL免疫微球混合,然后加入90 μL PBST緩沖液,混勻后滴加在試紙條的加樣孔,5 min后觀察結(jié)果。

    1.2.4 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的靈敏度

    將金黃色葡萄球菌DNA系列稀釋為5 ng、500 pg、50 pg、5 pg、500 fg、50 fg 和 5 fg,RPA 擴(kuò)增后取 100 μL產(chǎn)物加到試紙條樣品孔中,再加入3.5 μL包被抗體的微球,充分混勻,滴加到試紙條樣品墊上,5 min后觀察結(jié)果。取100 μL金黃色葡萄球菌加入含有10 mL LB培養(yǎng)液中,37℃,200 r/min搖床培養(yǎng)8 h,取出后用0.9%NaCl溶液1∶10梯度稀釋加入平板計(jì)數(shù)瓊脂中,第2天進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。再準(zhǔn)備金黃色葡萄球菌純菌液依次稀釋為 1.2×107、1.2×106、1.2×105、1.2×104、1.2×103、1.2×102、1.2×101CFU/mL 和 1.2×100CFU/mL,使用水煮法提取基因組DNA,即取1 mL菌液置于99℃條件下裂解10 min,后迅速置于冰上冷卻10 min,最后10 000 r/min離心5 min,取上清即為DNA。用RPA最佳體系進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增后100 μL混合物滴加在試紙條樣品孔中,室溫靜置5 min后觀察結(jié)果。

    1.2.5 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的特異性

    提取金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌DNA進(jìn)行RPA-LMTS特異性驗(yàn)證。上述試驗(yàn)菌株DNA作為試驗(yàn)?zāi)0澹紫冗M(jìn)行RPA擴(kuò)增,然后取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用PBST稀釋至100 μL,再加入3.5 μL包被抗體的彩色乳膠微球,充分混勻,滴加到試紙條樣品墊上,每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,5 min后觀察檢測(cè)結(jié)果。

    1.2.6 RPA-LMTS檢測(cè)實(shí)際樣品

    通過(guò)GB 4789.10-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》鑒定樣品中是否含金黃色葡萄球菌。分別稱(chēng)取25 g(mL)的雞肉、豬肉和牛奶,向其中分別添加1.2×100CFU/g(mL)的金黃色葡萄球菌純菌液。將被人工污染的金黃色葡萄球菌樣品加入到含有225 mL的7.5%NaCl肉湯培養(yǎng)基。分別在培養(yǎng)0、1、2、3、4小時(shí)后采集培養(yǎng)物,應(yīng)用水煮法提取基因組DNA,作為RPA體系的模板。應(yīng)用RPA最佳體系進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后將100 μL混合物加到試紙條樣品孔中,5 min后觀察結(jié)果。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 靈敏度分析

    靈敏度檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌靈敏度Fig.1 Sensitivity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

    金黃色葡萄球菌不同濃度DNA為模板進(jìn)行RPA試驗(yàn),產(chǎn)物用微球試紙條檢測(cè),如圖1a所示,檢測(cè)限為500 fg DNA。為確定RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌液的檢測(cè)限,將金黃色葡萄球菌純菌液從1.2×106CFU/mL 10倍梯度依次稀釋至1.2×100CFU/mL。如圖1b所示,隨著金黃色葡萄球菌的濃度增加,檢測(cè)線亮度逐漸增加,當(dāng)濃度為1.2×101CFU/mL時(shí),檢測(cè)線亮度與陰性對(duì)照有明顯不同。因此,濃度為1.2×101CFU/mL是檢測(cè)金黃色葡萄球菌純菌液的檢測(cè)限。

    2.2 特異性分析

    特異性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

    選擇金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157∶H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌和單增李斯特菌驗(yàn)證RPALMTS特異性,結(jié)果顯示只有金黃色葡萄球菌出現(xiàn)質(zhì)控線和檢測(cè)線,而非金黃色葡萄球菌只有一條質(zhì)控線。結(jié)果說(shuō)明RPA-LMTS特異性良好,不會(huì)與其他菌株發(fā)生交叉反應(yīng)。

    圖2 RPA-LMTS對(duì)金黃色葡萄球菌特異性Fig.2 Specificity of the RPA-LMTS assay in detection of S.aureus

    2.3 實(shí)際樣品檢測(cè)分析

    為驗(yàn)證RPA-LMTS檢測(cè)金黃色葡萄球菌的實(shí)用性,選擇牛肉、雞肉和牛奶為待測(cè)實(shí)際樣品,分別接種1.2×100CFU/mL(g)金黃色葡萄球菌,37℃增菌不同時(shí)間后收集提取DNA進(jìn)行RPA-LMTS檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示1.2×100CFU/mL(g)金黃色葡萄球菌在牛肉、雞肉和牛奶中增菌3小時(shí)后可被檢測(cè)出。

    圖3 金黃色葡萄球菌增菌不同時(shí)間RPA-LMTS檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Detection of S.aureus in simulated food samples by RPALMTS after incubation for different times

    3 討論

    近年來(lái),像LAMP[14],依賴(lài)HDA[15]和RPA等多種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于擴(kuò)增核酸。LAMP是基于Bst DNA聚合酶進(jìn)行鏈置換和DNA合成,LAMP可以在60 min內(nèi),60℃~65℃條件下進(jìn)行DNA擴(kuò)增[16]。然而LAMP需要4~6對(duì)的引物,且需要跨越6個(gè)不同的靶序列,引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜。HDA是利用DNA解旋酶打開(kāi)雙鏈DNA,并產(chǎn)生單鏈模板用于引物雜交和擴(kuò)增。使用解旋酶消除了對(duì)復(fù)雜加熱設(shè)備的需求,使反應(yīng)能在較低的溫度下進(jìn)行。但在進(jìn)行HDA前通常需要優(yōu)化試驗(yàn)條件,如緩沖液組成和反應(yīng)溫度等,增加試驗(yàn)成本[5]。與以上相比,本研究通過(guò)建立了RPA-LMTS快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌,RPA可在40℃條件下擴(kuò)增金黃色葡萄球菌,大大降低對(duì)試驗(yàn)設(shè)備的要求。

    RPA是目前最快的核酸擴(kuò)增技術(shù)之一,20 min內(nèi)即可完成檢測(cè),RPA主要依賴(lài)于三種酶:重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白酶和鏈置換DNA聚合酶。在RPA反應(yīng)中,重組酶先與引物形成復(fù)合物,重組酶-引物復(fù)合物再與靶目標(biāo)結(jié)合,然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增[17]。RPA還具有以下優(yōu)勢(shì):第一,可以在相對(duì)較低的溫度下(37℃~42℃)反應(yīng)[18];第二,如果樣品中含有某些雜質(zhì)也不會(huì)影響RPA,可省去DNA純化過(guò)程,更加便捷和快速[19];第三,RPA體系中的酶呈凍干態(tài),運(yùn)輸時(shí)不需冷藏,更加便于運(yùn)輸。當(dāng)本研究使RPA與LMTS的結(jié)合后檢測(cè)更加快速,同時(shí)靈敏度提高。RPA-LMTS僅需15 min即可獲得結(jié)果(包括10 min擴(kuò)增和5 min檢測(cè)),檢測(cè)限為500 fg DNA和1.2×101CFU/mL純菌液,且與非金黃色葡萄球菌無(wú)交叉反應(yīng),當(dāng)實(shí)際樣品污染量為1.2×100CFU/mL(g)金黃色葡萄球菌時(shí),可在3.5 h內(nèi)完成檢測(cè)。RPA-LMTS可應(yīng)用于在基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)金黃色葡萄球菌。

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