微生物發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶及釋放阿魏酸研究概述

孫曉明，辛嘉英，，*，王艷，吳永存，王寧，陳書明

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A）[1]，其化學(xué)名稱為 4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是普遍存在于植物細(xì)胞壁中的一種酚酸，有兩種異構(gòu)體：順式和反式，順式阿魏酸為黃色油狀物，一般指的反式阿魏酸為微黃色或白色斜方晶體，相對分子量194.29，熔點(diǎn)為174℃。反式阿魏酸水溶性差，穩(wěn)定溶于乙醇，難溶于冷水、石油醚、苯，可溶于熱水、丙酮、甲醇。自然界中[2]，阿魏酸以酯鍵和醚鍵分別在木質(zhì)素與木質(zhì)素之間、半纖維素與半纖維素之間、木質(zhì)素與半纖維素之間相連接從而在植物細(xì)胞壁間形成致密的網(wǎng)狀骨架結(jié)構(gòu)，從空間上阻礙了纖維素酶和半纖維素酶的降解作用，使得整個細(xì)胞壁變得堅硬。自然條件下的阿魏酸有水溶態(tài)、脂溶態(tài)和束縛態(tài)。水溶態(tài)阿魏酸存在于植物的細(xì)胞質(zhì)中，該狀態(tài)下的阿魏酸與一些小分子（單糖、二糖、多胺等）結(jié)合呈易溶態(tài)；脂溶態(tài)是指阿魏酸與一些脂溶性物質(zhì)（甾醇等）結(jié)合，主要存在與植物表面的蠟質(zhì)層中；束縛態(tài)指阿魏酸以酯或醚的形式與植物細(xì)胞壁物質(zhì)（多糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素）結(jié)合[3]。

阿魏酸是國際公認(rèn)的天然安全抗氧化劑，也是近年來認(rèn)知度極高的防癌物質(zhì)。具有降血脂、防治冠心病、抗血栓、抗氧化、抗菌消炎、抗突變和防癌等生理功能，被廣泛應(yīng)用于保健品、食品添加劑、化妝品和醫(yī)藥等領(lǐng)域[4-5]。制備阿魏酸的主要方法有：從植物中直接提取法、化學(xué)合成法和生物合成法。化學(xué)合成法和生物合成法提取成本高，能耗大，不利于節(jié)約環(huán)保，所以采用酶法發(fā)酵從植物細(xì)胞壁中提取阿魏酸的綠色清潔生產(chǎn)方法由于其對環(huán)境友好、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和，已成為廣泛研究的熱點(diǎn)[6-8]。

真菌、細(xì)菌和酵母都能分泌的阿魏酸酯酶（ferulic acid esterase，F(xiàn)AE）[9]是指能將阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中阿魏酸游離出來的一種酶。屬于羥基酸酯酶的一個亞綱，能打斷阿魏酸在谷物細(xì)胞壁中以單體和多種二聚體的形式為主與阿拉伯木聚糖和阿拉伯糖殘基相連接的酯鍵[10-12]，破壞細(xì)胞壁骨架結(jié)構(gòu)，從而釋放阿魏酸。

本文主要對近年來國內(nèi)外用不同產(chǎn)酶微生物來發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶以及酶法發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為研發(fā)阿魏酸新工藝提供研究依據(jù)。

1 產(chǎn)阿魏酸酯酶研究進(jìn)展

1.1 阿魏酸酯酶的培養(yǎng)條件及微生物來源

在植物細(xì)胞壁中，阿魏酸主要以酯鍵連接到存在于細(xì)胞壁的阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖殘基上，還有一部分以阿魏酸二聚體的形式連接到阿拉伯木聚糖聚合物上，阿魏酸酯酶可以打斷阿魏酸與細(xì)胞壁多糖的連接，高效降解多糖并獲得低聚糖及阿魏酸[10-12]。自1987年MACKENZIE CR等[13]培養(yǎng)橄欖色鏈霉菌（Streptomyces olivochromogenes）時發(fā)現(xiàn)了阿魏酸酯酶，此后阿魏酸酯酶被認(rèn)為是半纖維素水解酶。研究表明真菌、細(xì)菌和酵母都能分泌阿魏酸酯酶，目前從微生物中分離得到的FAE已達(dá)40多種。但絕大多數(shù)阿魏酸酯酶從真菌中分離得到，如黑曲霉（Aaspergillus niger）被普遍應(yīng)用于科學(xué)研究，隨著研究深入和技術(shù)水平先進(jìn)化，其它的產(chǎn)酶菌種逐漸被發(fā)現(xiàn)如泡盛曲霉（Aspergillus awamori）、鏈霉菌（如 Streptomyces avermitilis）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、乳酸桿菌（Lactobacilli）等。目前的研究發(fā)現(xiàn)，不同微生物產(chǎn)阿魏酸酯酶的酶學(xué)特性有著較大的差異，來源于真菌阿魏酸酯酶酶活性較好。部分阿魏酸酯酶的微生物發(fā)酵來源以及培養(yǎng)條件詳見表1。

表1 自2000年以來部分產(chǎn)阿魏酸酯酶（FAE）的微生物來源及培養(yǎng)條件Table 1 Partial production of feruloyl esterase（FAE）from microbial sources and culture conditions since 2000

1.2 產(chǎn)阿魏酸酯酶的影響因素及理化性質(zhì)

阿魏酸酯酶的真菌微生物固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基最主要是含淀粉基和纖維素基，如甜菜渣、玉米麩、小麥麩、豆渣和醋糟。Shin等[14]以去淀粉麥麩和麥麩為發(fā)酵底物對比，發(fā)現(xiàn)麥麩的發(fā)酵產(chǎn)酶最高，接近去淀粉麥麩的2倍，表明去除麥麩中的淀粉后進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶量會下降。并且以淀粉為唯一碳源發(fā)酵，其結(jié)果與以木糖為唯一碳源一樣，都不產(chǎn)阿魏酸酯酶，其原因可能與阿魏酸酯酶的誘導(dǎo)機(jī)制有關(guān)。麥麩中的淀粉可能僅僅有利于菌體發(fā)酵初期的生長，對阿魏酸酯酶的產(chǎn)生無誘導(dǎo)作用。阿魏酸酯鍵可能是誘導(dǎo)阿魏酸酯酶產(chǎn)生的主要因素，這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究阿魏酸酯酶提供良好基礎(chǔ)。李干[15]經(jīng)過對培養(yǎng)基的優(yōu)化以及培養(yǎng)條件的測定，發(fā)現(xiàn)非誘導(dǎo)性碳源（葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘油、阿魏酸）存在的培養(yǎng)基中基本不產(chǎn)生阿魏酸酯酶，當(dāng)糖有消耗后，才開始有微量的酶活。這可能是由于糖分解代謝物的阻遏作用。目前纖維素也可用于產(chǎn)生阿魏酸酯酶[23]。由于不同微生物來源的FAE酶學(xué)特性有著較大的差異：大部分相對分子量在30 kDa～70 kDa之間有但是Neocallimastix MC-2所產(chǎn)阿魏酸酯酶相對分子質(zhì)量為11 kDa；最適pH值為4～8之間，在pH 3～10范圍內(nèi)穩(wěn)定；最適溫度及熱穩(wěn)定性為30℃～65℃；等電點(diǎn)在3～9.9之間不等。A.pullulans所產(chǎn)阿魏酸酯酶相對分子質(zhì)量為210 kDa，等電點(diǎn)為6.5，最適pH值為6.7，最適溫度為60℃。鄧軼韜等[24]在對黑曲霉發(fā)酵去淀粉麥麩產(chǎn)的阿魏酸酯酶時，以葡萄糖為誘導(dǎo)碳源研究時發(fā)現(xiàn)麩皮的半纖維結(jié)構(gòu)能有效的誘導(dǎo)產(chǎn)阿魏酸酯酶，并且碳氮源可以在發(fā)酵前期促進(jìn)菌體快速大量生長。對于不同氮源，有機(jī)氮源如酵母提取物、蛋白胨為氮源時酶活大于硫酸銨、硝酸銨無機(jī)氮源，不同的菌株會喜好有利于自己生長和產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物的氮源。以1%接種量和近中性的pH值更有利于產(chǎn)酶。通過優(yōu)化后菌株的酶活提高了37%。

1.3 產(chǎn)阿魏酸酯酶的分子克隆及專利

由于大多數(shù)微生物發(fā)酵產(chǎn)阿魏酸酯酶的量達(dá)不到工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的要求，在尋找新的FAE和應(yīng)用來源方面，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界都在積極研究。自2000年以來專利申請情況見表2[9]。

表2 自2000年以來阿魏酸酯酶申請和授予專利[9]Table 2 Ferulic acid esterase applications and patents granted since 2000

續(xù)表2 自2000年以來阿魏酸酯酶申請和授予專利[9]Continue table 2 Ferulic acid esterase applications and patents granted since 2000

專利中大部分包括微生物來源的FAE，其多肽序列，編碼多肽的核苷酸，核酸構(gòu)體，載體和包含該核苷酸的宿主細(xì)胞以及生產(chǎn)和使用該多肽的方法。利用現(xiàn)代生物技術(shù)優(yōu)化微生物基因，以達(dá)到提高阿魏酸酯酶產(chǎn)量的目的。目前不同微生物來源的FAE被異源克隆或以其他方式克隆后，發(fā)酵不同農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的研究較少。Record等[25]將一種新構(gòu)建的含有黑曲霉FAE A編碼序列的cDNA載體轉(zhuǎn)入有蛋白酶基因表達(dá)缺陷的黑曲霉菌株中。以葡萄糖為碳源（60 g/L），阿魏酸酯酶活性為1.236 U/mL并且該酶易于純化。Levasseur等[26]將來自黑曲霉BRFM13的FAE B基因插入到gpd啟動子控制下的表達(dá)載體中，使其在蛋白酶基因表達(dá)缺陷的黑曲霉菌株表達(dá)。轉(zhuǎn)化后的阿魏酸酯酶活性達(dá)到1.079 U/mL，比由甜菜漿誘導(dǎo)的相同來源的非轉(zhuǎn)化黑曲霉菌株的產(chǎn)量高16倍。

Levasseur等[27]構(gòu)建了一種由AnFaeA和里氏木霉組成的嵌合酶。轉(zhuǎn)入里氏木霉Rut30和CL847菌株中分別表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Rut30產(chǎn)阿魏酸酯酶的活力比CL847菌株中的低。Abokitse等[28]研究來自溫性厭氧菌的TtFaeA轉(zhuǎn)入大腸桿菌后發(fā)酵小黑麥糠釋放阿魏酸。反應(yīng)物先用木聚糖酶37℃處理16 h，表達(dá)后的阿魏酸酯酶55℃作用5 h。研究發(fā)現(xiàn)該酶熱穩(wěn)定性高達(dá)80℃，可釋放30%的阿魏酸。Wong等[6]將來自黑曲霉的AnfaeA基因克隆并轉(zhuǎn)入到釀酒酵母中，發(fā)酵柳枝稷釋放阿魏酸約3.01 μg/100 mg（總釋放阿魏酸2 mg/g）。細(xì)菌來源的阿魏酸酯酶能從小黑麥麩皮，干燥的麥麩以及蒸汽爆炸處理后的小麥秸稈中釋放出大量的阿魏酸。Wu等[5]將來自纖維堆囊菌（Sorangium cellulosum）的阿魏酸酯酶ScFae1和ScFae2轉(zhuǎn)入大腸桿菌細(xì)胞純化后發(fā)酵小黑麥麩皮，將0.45 U/mL克隆表達(dá)后的酶與5.3 U/mL木聚糖酶液態(tài)發(fā)酵5%黑小麥麩皮懸浮液，37℃發(fā)酵3 h。阿魏酸的最大釋放量為96%。

2 釋放阿魏酸的生產(chǎn)工藝及影響因素

現(xiàn)有微生物發(fā)酵釋放阿魏酸方式主要有固體發(fā)酵與液體發(fā)酵兩種：固態(tài)發(fā)酵（solidstate fermentation，SSF）和液態(tài)發(fā)酵（submerged fermentation，SmF）。液態(tài)發(fā)酵比固態(tài)發(fā)酵過程要復(fù)雜，實(shí)際工廠生產(chǎn)設(shè)備投資較大。固態(tài)發(fā)酵[9]包括將固體懸浮在液體中的深層發(fā)酵和幾乎沒有游離水的濕固體材料上培養(yǎng)微生物的工藝過程。所用原料一般為經(jīng)濟(jì)易得、富含營養(yǎng)物質(zhì)的工農(nóng)業(yè)副、廢產(chǎn)品，如麩皮、薯粉、大豆餅粉、高粱、玉米粉等。并且具有生產(chǎn)效率高、工藝簡單、操作粗放、能耗少、廢液少、產(chǎn)物分離較容易等優(yōu)點(diǎn)倍受重視，有可能產(chǎn)生一些在液體培養(yǎng)中不產(chǎn)生的酶和其他有益代謝產(chǎn)物。張憬等[29]利用液態(tài)深層發(fā)酵法生產(chǎn)同時含有阿魏酸酯酶和阿拉伯木聚糖酶的混合酶制劑，協(xié)同作用于去淀粉麥麩制備阿魏酸和低聚糖，經(jīng)3次降解后阿魏酸總得率為55.46%。由于小麥麩皮細(xì)胞壁是由纖維素、半纖維素和蛋白質(zhì)等多種高聚物組成，半纖維素（主要為阿拉伯木聚糖）和木質(zhì)素通過阿拉伯糖和阿魏酸等橋鏈作用形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，很難降解。由此可以推測阿魏酸酯酶、木聚糖酶和纖維素酶3種酶共同作用，同時切斷木聚糖間的酯鍵長鏈和降低纖維素間的阻礙作用，阿魏酸釋放率將會得到進(jìn)一步的提高。

微生物固態(tài)發(fā)酵釋放阿魏酸的影響因素有發(fā)酵底物基質(zhì)的顆粒大小、水分活度、溫度、接種濃度、pH值等。Samad K A等[30]用芽孢桿菌發(fā)酵香蕉莖稈廢物并應(yīng)用共培養(yǎng)法釋放阿魏酸，研究幾種影響釋放阿魏酸因素的影響力。結(jié)果表明：pH值＞共培養(yǎng)類型＞接種量＞攪拌＞發(fā)酵時間＞溫度＞料液比。pH值，攪動，共培養(yǎng)類型和接種量對阿魏酸生產(chǎn)具有顯著影響。在交互性因素中，pH值和溫度與發(fā)酵時間的相互作用對阿魏酸產(chǎn)量的影響最大。

在植物細(xì)胞壁中阿魏酸主要以酯鍵的形式連接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖側(cè)鏈殘基上，纖維素與木聚糖之間的空間阻礙會影響阿魏酸酯酶的作用能力，從而影響酶與底物的有效接觸，所以單一使用阿魏酸酯酶水解釋放阿魏酸的效率不理想。已有報道表明，阿魏酸酯酶可以協(xié)同纖維素酶以及木聚糖酶提高植物纖維質(zhì)中阿魏酸的釋放量[31]。

龔燕燕等[32]用阿魏酸酯酶與木聚糖酶協(xié)同作用降解麥麩制備阿魏酸的研究中發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶和阿魏酸酯酶協(xié)同作用，木聚糖酶先將細(xì)胞壁中的半纖維素降解為相對分子質(zhì)量相對較小的阿魏酸寡聚多糖，改變細(xì)胞壁的物理化學(xué)性質(zhì)有利于阿魏酸酯酶作用于阿魏酸寡聚多糖，能促進(jìn)釋放FA，當(dāng)木聚糖酶添加量為300 U時，F(xiàn)A的釋放率從19.48%上升至70.10%。Topakas等[33]的報道也證明阿魏酸酯酶是釋放阿魏酸的關(guān)鍵酶，木聚糖的添加能促進(jìn)阿魏酸酯酶進(jìn)一步釋放阿魏酸，兩者具有良好的協(xié)同作用，能有效降解小麥麩皮，提高阿魏酸的釋放率。

曾妍等[34]用阿魏酸酯酶與纖維素酶協(xié)同降解麥麩釋放阿魏酸，單獨(dú)使用阿魏酸酯酶30 U時阿魏酸的釋放率僅為4.1%，單獨(dú)使用纖維素酶并不釋放阿魏酸，當(dāng)兩種酶協(xié)同作用時，阿魏酸的釋放率明顯提高，經(jīng)單因素試驗(yàn)確定雙酶協(xié)同作用的最佳條件為：阿魏酸酯酶的最適添加量為30U協(xié)同纖維素酶的最適添加量為70 U，此時阿魏酸釋放率達(dá)到22.9%，是阿魏酸單獨(dú)作用時的5.58倍，水解時間為10 h，水解溫度為40℃，水解pH值為5.0，料液質(zhì)量體積比為1∶30（g/mL），此時阿魏酸的釋放率為23.6%。

Wang 等[31]從嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）中分離得到的一種新型阿魏酸酯酶，單獨(dú)使用水解100 mg去淀粉麥麩并不釋放阿魏酸，分別與木聚糖酶和α-L-阿拉伯糖苷酶協(xié)同作用最大可以得到12.4 nmol和3.64 nmol的阿魏酸，3種酶共同作用最大可以得到15.7 nmol的阿魏酸，證明以木聚糖酶為主，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶為輔可以協(xié)同作用阿魏酸酯酶促進(jìn)阿魏酸的釋放。

Wu Hongli等[35]用木聚糖酶（AnXyn11A）和阿魏酸酯酶協(xié)同降解麥麩，得到產(chǎn)率較高的阿魏酸和低聚木糖。AnXyn11A在pH 5.0和60℃時最大活性為240 U/mL。AnFaeA在pH 5.0和45℃時最大活性為21 U/mL的。AnXyn11A和AnFaeA協(xié)同作用于去淀粉麥麩（DSWB），釋放的FA與單獨(dú)酶作用下（僅釋放FA的16.8%）相比增加至70%。

Wu等[5]用在大腸桿菌中表達(dá)的新型阿魏酸酯酶ScFAE2發(fā)酵黑小麥麩皮即得阿魏酸為2.22 mg/g；Benoit I等[36]用來自黑曲霉的阿魏酸酯酶發(fā)酵玉米麩皮獲得阿魏酸的得率是31.22 mg/g；Xie C等[37]用來自猴頭菌的阿魏酸酯酶發(fā)酵麥麩即得阿魏酸4 mg/g；Schmidt等[38]用米根霉（Rhizopus oryzae）固態(tài)發(fā)酵的方法發(fā)酵米糠，從未發(fā)酵前33 mg/g到發(fā)酵后含量為765 mg/g。

3 結(jié)束語及展望

對農(nóng)林廢棄物中阿魏酸的研究一直是糧油加工、生物工程等學(xué)科的研究熱點(diǎn)之一。微生物采用固態(tài)發(fā)酵降解麥麩、米糠等廢棄物釋放阿魏酸比液態(tài)發(fā)酵有更好的可控條件，但是由于不同微生物來源的阿魏酸酯酶的酶特異性不同，所以對發(fā)酵條件如固態(tài)基質(zhì)的選擇、溫度、pH值、料液比等的最優(yōu)選擇亟待解決。

目前，微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)阿魏酸得率不佳，表明距離具體工業(yè)化生產(chǎn)仍有一定的差距所以在發(fā)酵過程中可采取如蒸汽爆破等輔助手段來提高阿魏酸的釋放率。所以要使農(nóng)林廢棄物中阿魏酸在工業(yè)上得到充分生產(chǎn)應(yīng)用，不僅要在現(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)對產(chǎn)阿魏酸酯酶的基因進(jìn)行改良還要找到生產(chǎn)過程中每一個步驟的有效契合點(diǎn)，對工藝參數(shù)進(jìn)行分析、構(gòu)建、優(yōu)化和創(chuàng)新。找到合適的發(fā)酵條件、培養(yǎng)條件，建立一套實(shí)用性強(qiáng)、節(jié)約成本的生產(chǎn)方法。