響應(yīng)面優(yōu)化水酶法提取紅樹(shù)莓籽油工藝

王新明，呂長(zhǎng)鑫，*，蘆宇，紀(jì)秀鳳，巴俊文，李思逸，王維民，趙玉梅

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.大連中超食品有限公司，遼寧大連116400；3.朝陽(yáng)本色有機(jī)食品有限公司，遼寧朝陽(yáng)122000）

紅樹(shù)莓（red respberry）又稱(chēng)托盤(pán)、懸鉤子、覆盆子和紅馬林等，為薔薇科懸鉤子屬多年生落葉小灌木型果樹(shù)[1]。果實(shí)色澤艷麗、干爽多汁、風(fēng)味獨(dú)特，富含水楊酸、鞣花酸、黃酮和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種保健成分[2]，被譽(yù)為“黃金水果”，并被列為“第三代水果”[3]。近年來(lái)，我國(guó)紅樹(shù)莓加工業(yè)是一種迅速崛起的新興產(chǎn)業(yè)，主要集中于飲料、果酒和罐頭制品的加工。隨著紅樹(shù)莓可食用部分的生產(chǎn)加工，大量紅樹(shù)莓籽作為加工副產(chǎn)物尚未得到有效利用[4-5]。研究表明，紅樹(shù)莓籽約占紅樹(shù)莓鮮果的10%，籽中含有油脂、花青素、多酚和黃酮等有益成分[6]。紅樹(shù)莓籽中油脂含量較高且紅樹(shù)莓籽油中不飽和脂肪酸和人體必需脂肪酸含量豐富，主要為亞油酸和亞麻酸，具有抗氧化、消炎和預(yù)防疾病等功能[7]。故將紅樹(shù)莓籽油開(kāi)發(fā)為營(yíng)養(yǎng)保健產(chǎn)品，將會(huì)有廣泛應(yīng)用前景。植物油脂提取方法較多，如索氏抽提法、有機(jī)溶劑萃取、超聲波法、微波法和超臨界CO2萃取等，這些提取方法操作繁瑣且存在有機(jī)溶劑殘留，故存在一定缺陷。水酶法是利用蛋白酶、果膠酶和纖維素酶等來(lái)破壞油料種子的脂蛋白和細(xì)胞壁，使油脂從植物細(xì)胞中釋放出來(lái)[8]。水酶法具有工藝簡(jiǎn)單、條件溫和、無(wú)溶劑殘留和綠色安全等特點(diǎn)[9]。因此，本研究擬采用響應(yīng)面優(yōu)化水酶法提取紅樹(shù)莓籽油的工藝，以期為提取紅樹(shù)莓籽油的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹(shù)莓籽：大連中超食品有限公司；Alcalase2.4 L堿性蛋白酶（酶活力2.4AU-A/g）（生物制劑）：諾維信生物技術(shù)公司；氫氧化鈉、檸檬酸鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Centrifuge5804R冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；GT-100震動(dòng)球磨儀：北京格瑞德曼有限公司；SHA-2冷凍水浴恒振蕩器：金壇市瑞華儀器有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PL303型電子天平、FiveEasy Plus pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 操作要點(diǎn)

去除紅樹(shù)莓籽中雜質(zhì)、洗凈、恒溫干燥后，粉碎過(guò)60目篩，稱(chēng)取一定質(zhì)量紅樹(shù)莓籽置于錐形瓶中，加入一定體積蒸餾水，45℃預(yù)熱1 h，調(diào)節(jié)pH值后加入堿性蛋白酶，一定溫度酶解反應(yīng)后90℃水浴滅酶10 min，6 000 r/min條件下離心10 min，收集上層油脂干燥至恒重，得到紅樹(shù)莓籽油。

1.4.2 紅樹(shù)莓籽油提取得率計(jì)算

紅樹(shù)莓籽油提取得率按下式計(jì)算：

式中：W為樹(shù)莓籽油提取得率，%；m1為錐形瓶和瓶?jī)?nèi)紅樹(shù)莓籽油質(zhì)量，g；m2為錐形瓶質(zhì)量，g；m為紅樹(shù)莓籽粉質(zhì)量，g。

1.4.3 紅樹(shù)莓籽油提取單因素試驗(yàn)

1.4.3.1 酶添加量對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響

分別稱(chēng)取5份過(guò)篩紅樹(shù)莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在料液比 1 ∶5（g/mL）、pH 8.0、酶解時(shí)間 4 h、酶解溫度45℃的條件下，分別考察堿性蛋白酶添加量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時(shí)對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響。

1.4.3.2 料液比對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響

分別稱(chēng)取5份過(guò)篩紅樹(shù)莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在酶添加量1.5%、pH 8.0、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度 45℃條件下，分別考察料液比為 1∶3、1∶4、1∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL）對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響。

1.4.3.3 酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響

分別稱(chēng)取5份過(guò)篩紅樹(shù)莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在料液比1∶5（g/mL）、酶添加量1.5%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度45℃條件下，分別考察酶解pH值為6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 時(shí)對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響。

1.4.3.4 酶解時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響

分別稱(chēng)取5份過(guò)篩紅樹(shù)莓籽粉30 g于250 mL錐形瓶中，在料液比1∶5（g/mL）、酶添加量1.5%、pH 8.0、酶解溫度45℃的條件下，分別考察酶解時(shí)間為2、3、4、5、6 h時(shí)對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響。

1.4.4 紅樹(shù)莓籽油提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Design Expert 8.0.6.1軟件的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以紅樹(shù)莓籽油提取得率（Y）為響應(yīng)值，酶添加量（A）、料液比（B）、酶解 pH 值（C）及酶解時(shí)間（D）為因素，因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 酶添加量對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響分析

堿性蛋白酶添加量對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響如圖1所示。

圖1 酶添加量對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage on the extraction rate of red raspberry seed oil

酶添加量為0.5%～2.0%時(shí)，提取率逐漸增加，這是因?yàn)榈鞍酌笇?duì)脂蛋白等復(fù)合體具有降解作用，酶與底物作用進(jìn)入脂質(zhì)體內(nèi)，對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)一步破壞，并對(duì)脂蛋白進(jìn)行分解，增加紅樹(shù)莓籽油料組織內(nèi)油脂流動(dòng)性，從而有利于油脂釋放[10]；酶添加量為2.0%時(shí)，提取得率最高；酶添加量大于2.0%后，提取得率略微下降，這是由于隨著酶添加量增加，酶與紅樹(shù)莓籽內(nèi)蛋白結(jié)合達(dá)飽和狀態(tài)，酶作用受限，且酶作為一種蛋白質(zhì)，對(duì)油脂有吸附作用，導(dǎo)致紅樹(shù)莓籽油提取得率下降[11]。因此，選擇適宜酶添加量為2.0%。

2.1.2 料液比對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響分析

料液比對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響如圖2所示。

料液比為 1 ∶3（g/mL）～1 ∶6（g/mL）時(shí)，提取得率逐漸增加，是因?yàn)檫m量水作為提取油脂過(guò)程中反應(yīng)介質(zhì)，對(duì)酶解反應(yīng)具有促進(jìn)作用[12]，且料液比過(guò)小，底物濃度較大，不利于酶對(duì)底物作用；料液比為1∶6（g/mL）時(shí)提取得率最高；料液比高于1∶6（g/mL）時(shí)，提取得率下降，由于料液比過(guò)大，底物濃度和酶濃度均較低，降低了酶反應(yīng)速度[13]。因此，選擇適宜料液比為1∶6（g/mL）。

圖2 料液比對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of red raspberry seed oil

2.1.3 酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響分析

酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響如圖3所示。

圖3 pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.3 EffectofpHvalueonextractionrateofredraspberryseedoil

pH 6～8時(shí)，提取得率逐漸增加；pH 8時(shí)，提取得率最高，這是因?yàn)锳lcalase2.4 L堿性蛋白酶最適pH值接近8，此條件下酶活高，酶對(duì)底物作用效果明顯，紅樹(shù)莓籽油提取得率最高[14]；當(dāng)pH值高于8時(shí)，提取得率逐漸下降。因此，選擇適宜提取pH值為8。

2.1.4 酶解時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響分析

酶解時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

酶解時(shí)間為2 h～4 h時(shí)，提取得率逐漸增加；酶解時(shí)間為4 h時(shí)提取得率最高，是因在適宜酶解時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，酶解作用完全，提取得率最高；酶解時(shí)間大于4 h時(shí)，紅樹(shù)莓籽油提取得率趨于穩(wěn)定，由于反應(yīng)達(dá)到一定時(shí)間時(shí)底物減少，提取得率趨于恒定，且酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)增加能耗，對(duì)油品質(zhì)也有不利影響[15]。因此，選擇適宜酶解時(shí)間為4 h。

2.2 紅樹(shù)莓籽油提取響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面模型建立及顯著性分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型優(yōu)化紅樹(shù)莓籽油提取工藝，以紅樹(shù)莓籽油提取得率（Y）為響應(yīng)值，考察酶添加量（A）、料液比（B）、酶解 pH值（C）和酶解時(shí)間（D）對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Arrangement and corresponding results of Box-Behnken experimental design

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程為：Y=6.27-0.019A+0.1B+0.11C-0.051D-0.033AB-0.32AC-0.017AD+0.31BC+0.097BD+0.28CD-0.52A2-0.62B2-0.93C2-0.23D2。該模型方差分析見(jiàn)表3，模型 p＜0.000 1，失擬項(xiàng) p=0.465 2＞0.05，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明可用此模型對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；R2=0.911 3，說(shuō)明該回歸方程擬合度較好；CV=4.67%，說(shuō)明其置信度較高；信噪比RSN=10.401，模型可調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.825 5，說(shuō)明數(shù)據(jù)有較高可靠性。由F值可知，4個(gè)考察因素對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取率影響依次為：C＞B＞D＞A。模型中 A2、B2、C2對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取率影響極顯著，AC、BC、CD、D2影響顯著，其余項(xiàng)為不顯著。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance for the established regression model

續(xù)表3 方差分析表Continue table 3 Analysis of variance for the established regression model

2.2.2 響應(yīng)面各因素間交互作用分析

圖5～圖10為不同變量交互作用對(duì)提取得率影響的響應(yīng)面圖。在固定酶添加量（A）、料液比（B）、酶解pH值（C）和酶解時(shí)間（D）其中兩因素的條件下，紅樹(shù)莓籽油提取得率分別隨著各因素的增加而增加，達(dá)到最大值后隨各因素的增加而降低。響應(yīng)面圖可以直觀反映各變量對(duì)響應(yīng)值的影響，等高線圖形狀可以反映出各因素間交互作用強(qiáng)弱。在三維空間響應(yīng)面圖中，其曲面坡度陡峭表明對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響顯著，反之平緩則不顯著。等高線圖中，其線性呈橢圓或趨向橢圓，表明對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響顯著，呈圓形則不顯著。并且橢圓排列越密集，說(shuō)明在兩因素變化時(shí)，對(duì)響應(yīng)值影響越大，越接近橢圓形區(qū)域中心，紅樹(shù)莓籽油提取得率越高，越遠(yuǎn)離橢圓形區(qū)域中心，紅樹(shù)莓籽油提取得率越低[16]。

圖5 酶添加量與pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage and pH value on extraction rate of red raspberry seed oil

圖5a～圖5b為確定料液比和酶解時(shí)間基礎(chǔ)上，考量酶添加量與酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓油提取得率影響關(guān)系。圖5a表明，當(dāng)酶解pH值不變時(shí)，隨著酶添加量增加，紅樹(shù)莓油提取得率先增加后降低；同理，當(dāng)酶添加量不變時(shí)，紅樹(shù)莓油提取得率隨酶解pH值變化有類(lèi)似趨勢(shì)。酶添加量與酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓油提取得率影響顯著，曲面較陡。其交互作用等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面圖陡峭，且P＜0.05說(shuō)明兩因素交互作用影響顯著。

圖6 料液比與pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio and pH value on extraction rate of red raspberry seed oil

圖6a～圖6b為確定酶添加量和酶解時(shí)間基礎(chǔ)上，考量料液比與酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響程度。圖6a表明，當(dāng)酶解pH值不變時(shí)，隨著料液比增加，紅樹(shù)莓籽油提取得率先增加后降低；同理，當(dāng)料液比不變時(shí)，紅樹(shù)莓籽油提取得率隨酶解pH值變化有類(lèi)似趨勢(shì)。原因可能是隨料液比增加，水作為提取劑，將紅樹(shù)莓籽中易溶于水的物質(zhì)提取出來(lái)，從而不利于紅樹(shù)莓籽油的提取；隨酶解pH值增大，使堿性蛋白酶活性逐漸降低，不利于紅樹(shù)莓籽油溶出。酶添加量與酶解時(shí)間響應(yīng)面圖曲面較陡，等高線圖呈橢圓形，且P＜0.05說(shuō)明兩因素交互作用影響顯著。

圖7 pH值與提取時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.7 Effect of pH value and extraction time on extraction rate of red raspberry seed oil

圖7a～圖7b為固定酶添加量和料液比時(shí)，酶解時(shí)間與酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓油提取得率的影響。圖7a表明，當(dāng)酶解pH值不變時(shí)，隨著料液比增加，紅樹(shù)莓油提取得率先增加后降低；同理，當(dāng)酶解時(shí)間不變時(shí)，紅樹(shù)莓油提取得率隨酶解pH值的變化有類(lèi)似趨勢(shì)。酶解時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響不太顯著，曲面較平緩；酶解pH值對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響顯著，曲面較陡；兩因素交互作用等高線圖呈橢圓形，響應(yīng)面圖較陡峭，且P＜0.05說(shuō)明兩因素交互作用影響顯著。

圖8 酶添加量與料液比對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.8 Effect of enzyme dosage and solid-liquid ratio on extraction rate of red raspberry seed oil

圖9 酶添加量與提取時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.9 Effect of enzyme dosage and enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

圖8等高線圖相對(duì)偏圓，響應(yīng)面圖較陡，但P=0.797 4＞0.05，為不顯著；圖9～圖10中各因素交互作用等高線圖近似圓形，響應(yīng)面圖曲線較平緩，且P＞0.05說(shuō)明各因素交互作用不顯著；結(jié)合P值可知各因素對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率影響依次為：AC＞BC＞CD＞BD＞AB＞AD，其中 AC、BC、CD 交互作用顯著，BD、AB、AD交互作用不顯著。由圖5～圖10可知，當(dāng)其它因素取零水平時(shí)，隨著酶添加量、料液比、酶解pH值和酶解時(shí)間單一變量增大，紅樹(shù)莓籽油提取得率呈先升高后降低趨勢(shì)，故在選擇各因素參數(shù)范圍內(nèi)均存在極值，可對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取最佳工藝進(jìn)行預(yù)測(cè)。

圖10 料液比與提取時(shí)間對(duì)紅樹(shù)莓籽油提取得率的影響Fig.10 Effect of solid-liquid ratio and enzymolysis time on extraction rate of red raspberry seed oil

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果分析

由回歸方程求解得出紅樹(shù)莓籽油提取最佳工藝條件為料液比1∶5.46（g/mL）、酶添加量1.9%、提取時(shí)間3.88 h、pH 7.28，預(yù)測(cè)紅樹(shù)莓籽油提取得率在此工藝條件下為6.27%。為驗(yàn)證響應(yīng)面法優(yōu)化工藝結(jié)果可靠性，進(jìn)行3組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮實(shí)際操作條件，將預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶5.5（g/mL）、酶添加量1.9%、提取時(shí)間3.9 h、pH 7.3，結(jié)果顯示紅樹(shù)莓籽油提取得率的平均值6.25%，與預(yù)測(cè)值相差0.31%，證明結(jié)果可信度較高，可有效對(duì)水酶法提取紅樹(shù)莓籽油工藝進(jìn)行優(yōu)化及分析預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)選取加工副產(chǎn)物紅樹(shù)莓籽為原料，利用水酶法提取紅樹(shù)莓籽油。通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定水酶法提取紅樹(shù)莓籽油最佳工藝條件為：料液比1 ∶5.5（g/mL）、酶添加量 1.9%、提取時(shí)間 3.9 h、pH 7.3，紅樹(shù)莓籽油提取得率預(yù)測(cè)值6.27%，實(shí)際值6.25%，響應(yīng)面模型與實(shí)際擬合良好，在實(shí)際應(yīng)用中具有一定參考價(jià)值。