體外三維血管生成模型的建立及腫瘤細胞分泌的MCP-1/VEGF對該模型的影響*

胡 敏， 韓要武， 李 璐， 馬克龍， 呂 磊， 張道芹， 楊建澳， 汪思應

(1安徽中醫(yī)藥大學， 安徽 合肥 230012； 2安徽醫(yī)科大學， 安徽 合肥 230032)

惡性腫瘤已成為嚴重危害人類生命健康第1位的疾病。最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2018 年全球新增腫瘤病例1 800多萬，腫瘤死亡病例900多萬，其中全球 48.4%的發(fā)病病例和57.3% 的死亡病例來自亞洲[1]。惡性腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移是腫瘤患者的主要致死因素。因此針對惡性腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移及其機制的探索具有重要意義。腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成。

自1971年Folkman[2]提出如果沒有支持腫瘤生長的血管生成，實體瘤不能超過1～2 mm3的假設至今，已有40多年的研究結(jié)果證實，腫瘤血管生成在大多數(shù)實體腫瘤的生長和惡性進展中起重要作用[3-4]，是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的核心[2],因此抑制血管生成被認為是阻止腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的策略之一[5]。而建立簡單、穩(wěn)定、可靠的血管生成模型為研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展及血管生成提供了基礎。本項工作首先利用人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)及小鼠內(nèi)皮細胞SVEC4-10EE2在體外建立三維血管生成模型，在此基礎上加入腫瘤細胞(MDA-MB-231和E0771)與之共培養(yǎng)，觀察腫瘤細胞對血管生成的影響，并探究其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

Cytodex3磁珠購自Amersham Pharmacia；乙醇、纖維蛋白原、抑肽酶、凝血酶和SU5416購自Sigma；DMEM培養(yǎng)液、胰酶和小牛血清購自Gibco；鏈霉素、青霉素和兩性霉素B購自HyClone；EGM-2培養(yǎng)液購自Lonza；單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)及MCP-1受體C-C趨化因子受體2(C-C chemokine receptor 2,CCR2)拮抗劑購自Calbiochem；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和MCP-1酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購于北京華邁科生物技術(shù)有限公司。

2 主要方法

2.1細胞培養(yǎng) HUVECs購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)，從新鮮人胎盤中分離，并在EGM-2培養(yǎng)液中生長培養(yǎng)，使用第4代細胞用于實驗；小鼠血管內(nèi)皮細胞SVEC4-10EE2和人乳腺癌細胞MDA-MB-231在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)； 小鼠乳腺癌細胞E0771細胞在含有10%FBS、青霉素(1×105U/L)/鏈霉素(100 mg/L)和兩性霉素B(0.25 g/L)的DMEM培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。

2.2體外三維血管生成模型的建立 按照參考文獻進行模型的建立[6]。分別將正常培養(yǎng)生長的內(nèi)皮細胞HUVECs和SVEC4-10EE2用胰蛋白酶消化后，取1×106個細胞與4 mL含有cytodex3磁珠(3×103)的培養(yǎng)液后在50 mL離心管中混合。將混合液在5%CO2、37 ℃條件下溫育培養(yǎng)，每20 min輕輕搖動1次。培養(yǎng)4 h后再加入4 mL相應培養(yǎng)液，使細胞具有足夠的營養(yǎng)，并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后將含有細胞和cytodex3磁珠的混合液轉(zhuǎn)移至25 mL細胞培養(yǎng)瓶中孵育過夜。第2天，將培養(yǎng)瓶中的混合液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，并用20 mL不含Ca2+和Mg2+的PBS輕輕洗滌3遍，然后將包被有內(nèi)皮細胞HUVECs或SVEC4-10EE2的cytodex3磁珠重懸于pH 7.4、含有2.5 g/L纖維蛋白原和150 U/L抗胰蛋白酶的培養(yǎng)液中。接下來把包被有內(nèi)皮細胞的cytodex3磁珠和纖維蛋白原混合溶液加入預先用0.625 U新鮮凝血酶包被的24孔板中，每孔0.5 mL，使纖維蛋白原/磁珠溶液在室溫下凝結(jié)5 min，然后在37 ℃和5%CO2環(huán)境中凝結(jié)20 min。向每個孔中加入1 mL含有150 U/L抗胰蛋白酶的培養(yǎng)液,在37 ℃培養(yǎng)箱中平衡30 min。用移液器將24孔板內(nèi)上層培養(yǎng)液輕輕吸掉，用含有150 U/L抗胰蛋白酶的1 mL新鮮培養(yǎng)液替換。

2.3體外內(nèi)皮細胞-腫瘤細胞三維共培養(yǎng)系統(tǒng) 為了觀察腫瘤細胞對血管生成的影響，在體外三維血管生成模型基礎上，將人乳腺癌細胞MDA-MB-231和小鼠乳腺癌細胞E0771在體外與之共培養(yǎng)。方法同2.2，只是最后一步，在加入抗胰蛋白酶平衡的30 min等待時間內(nèi)，準備腫瘤細胞，消化、計數(shù)、調(diào)整細胞濃度。移液器將24孔板內(nèi)上層培養(yǎng)液輕輕吸掉后，用1 mL含有MDA-MB-231和E0771細胞(分別為4×104和2×104個)的培養(yǎng)液取代EGM-2和DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.4血管生成結(jié)果判斷 細胞培養(yǎng)48 h后，用4%多聚甲醛固定， DAPI染色，在倒置顯微鏡下觀察血管生成情況。每個培養(yǎng)孔隨機選取3個視野進行觀察，計算生成血管的磁珠占總數(shù)的百分比。實驗重復3次。

2.5酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子含量 在內(nèi)皮細胞及內(nèi)皮細胞-腫瘤細胞共培養(yǎng)體系培養(yǎng)48 h后，收集細胞培養(yǎng)的上清，嚴格按照酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，檢測 VEFG和MCP-1 的表達水平。

2.6VFGF及MCP-1對血管生成的影響 在內(nèi)皮細胞-腫瘤細胞共培養(yǎng)體系中分別加入MCP-1(10 ng)、MCP-1受體CCR2的拮抗劑(20 nmol/L)以及VEGF受體的抑制劑SU5416(2 μmol/L)作用48 h，觀察VEGF及MCP-1在腫瘤細胞刺激血管生成中的作用。

3 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組數(shù)據(jù)間比較用獨立t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 血管內(nèi)皮細胞體外三維血管生成模型

正常培養(yǎng)生長的人血管內(nèi)皮細胞HUVECs經(jīng)cytodex3磁珠混合培養(yǎng)4 h后，內(nèi)皮細胞可黏附于磁珠表面生長，培養(yǎng)過夜后內(nèi)皮細胞與磁珠的附著更加緊密。將附著有內(nèi)皮細胞的cytodex3磁珠懸浮于纖維蛋白凝膠中培養(yǎng)，48 h后可以觀察到內(nèi)皮細胞能夠形成短而窄的3-D脈管樣網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，見圖1A，提示血管的生成。接下來用4%多聚甲醛固定并用DAPI染色，在熒光顯微鏡下采集圖像，可以看到血管芽和毛細血管網(wǎng)由多細胞形成，見圖1B。結(jié)果證實建立了細胞體外三維血管生成模型。在小鼠內(nèi)皮細胞上也可以見到同樣的改變。

2 腫瘤細胞體外促進血管生成

在加入人乳腺癌細胞MDA-MB-231與HUVECs共培養(yǎng)后，顯著增加了血管芽的長度和數(shù)量，而且加入MDA-MB-231細胞共培養(yǎng)后生成血管的磁珠所占比例為68.7%，比HUVECs單獨培養(yǎng)時的48.3%顯著提高(P<0.05),見圖2A。在小鼠乳腺癌細胞E0771加入SVEC4-10EE2細胞后也能觀察到同樣的結(jié)果(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2.Tumor cells induce angiogenesis in vitro. A: The images of HUVECs with sprouts were captured at 48 h after culture. The percentage of beads with sprouts was determined (bottom panel); B: The images of SVEC4-10EE2 with sprouts were captured at 48 h after culture. The percentage of beads with sprouts was determined (bottom panel). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs HUVECs group； #P<0.05 vs SVEC4-10EE2 group.

3 腫瘤細胞體外促進MCP-1和VEGF分泌

在培養(yǎng)48 h后，分別收集有或無腫瘤細胞刺激的培養(yǎng)上清液，用ELISA法檢測上清液中VEFG和MCP-1 的水平。結(jié)果顯示，與內(nèi)皮細胞單獨培養(yǎng)相比，加入腫瘤細胞刺激之后，上清液內(nèi)VEFG和MCP-1 水平顯著增高(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.Tumor cells increased the expression of MCP-1 and VEGF in vitro. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs HUVECs group；#P<0.05 vs SVEC4-10EE2 group.

4 條件培養(yǎng)基(conditioned media, CM)對體外血管生成的影響

收集腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的上清液作為條件培養(yǎng)基(HUVEGs中加入的CM為HUVEGs與MDA-MB-231共培養(yǎng)的上清；SVEC4-10EE2中加入的CM為SVEC4-10EE2與E0771共培養(yǎng)的上清)，加入到 HUVECs或SVEC4-10EE2單獨培養(yǎng)的血管生成系統(tǒng)，在有或無MCP-1受體CCR2的拮抗劑以及VEGF受體抑制劑SU5416條件下觀察血管生成的情況。結(jié)果顯示，腫瘤細胞刺激后的條件培養(yǎng)上清可以促進內(nèi)皮細胞血管生成，而這一作用可以被CCR2的拮抗劑以及 SU5416 所阻斷(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effect of the conditioned medium on angiogenesis. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; ##P<0.05 vs CM group.

5 VEGF參與腫瘤細胞體外誘導的血管生成

結(jié)果顯示，加入VEGF受體抑制劑SU5416(2 μmol/L)后，腫瘤細胞MDA-MB-231及E0771誘導的血管生成受到了顯著的抑制(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.VEGF promoted the angiogenesis induced by cancer cells in vitro. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs co-culture group.

6 MCP-1參與腫瘤細胞促進的體外血管生成

外源性MCP-1可明顯促進內(nèi)皮細胞血管生成，而CCR2拮抗劑(20 nmol/L)可顯著抑制兩種腫瘤細胞(MDA-MB231或E0771)誘導的血管生成(P<0.05),見圖6。

Figure 6.MCP-1 promoted the angiogenesis of HUVECs and SVEC4-100E2 cells in vitro. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs MCP-1 group.

討 論

血管生成是腫瘤生長與轉(zhuǎn)移的重要條件, 也是血道轉(zhuǎn)移的根本保證[7]。大多數(shù)實體瘤分泌促血管生成因子，誘導血管生長，為生長中的腫瘤提供氧氣和營養(yǎng)，支持其進展并為腫瘤轉(zhuǎn)移提供通道[2,8]。在過去的幾十年中，血管生成受到了非常多的關(guān)注，靶向血管生成的治療成為控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的一個重要策略。建立血管生成模型可以為研究腫瘤發(fā)生及復發(fā)轉(zhuǎn)移提供基礎。腫瘤血管生成主要通過出芽的方式發(fā)生[9]。相對于二維血管生成模型，三維培養(yǎng)產(chǎn)生的細胞更接近于體內(nèi)細胞形態(tài)學表型和基因表達譜的特征[10-11]。因此，本研究中我們根據(jù)Chen等[6]的研究報道，建立一個穩(wěn)定、可重復、易操作的體外三維血管生成模型。實驗中所用的Cytodex3磁珠可以有效地附著和擴散細胞，并且可以容易地對附著的細胞進行顯微鏡檢查。纖維蛋白凝膠由親水性交聯(lián)原纖維組成，適用于3D細胞培養(yǎng)[12]。首先我們利用人或鼠的血管內(nèi)皮細胞(HUVEC或SVEC4-10EE2)包被于Cytodex3磁珠表面，并置于纖維蛋白凝膠系統(tǒng)中。內(nèi)皮細胞在不加入任何生長因子的條件下，在培養(yǎng)體系內(nèi)以“出芽”的方式形成短而窄的脈管樣結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果顯示，我們成功建立了一個體外血管生成模型。

接下來，我們想觀察腫瘤細胞對血管生成是否具有促進作用。利用成功建立的體外血管生成模型，在培養(yǎng)液上層纖維蛋白凝集物內(nèi)分別加入乳腺癌腫瘤細胞MDA-MB-231和E0771，使之與對應的正常內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)，建立一個3-D內(nèi)皮細胞-腫瘤細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)，即HUVECs/MDA-MB-231和SVEC4-10EE2/E0771共培養(yǎng)系統(tǒng)。培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察腫瘤細胞對血管生成的作用。結(jié)果顯示，加入腫瘤細胞共培養(yǎng)后，無論是HUVECs/MDA-MB-231還是SVEC4/E0771，形成血管芽的長度和數(shù)量顯著增加，出芽率顯著增高，提示腫瘤細胞在體外可以顯著促進血管生成。

由于內(nèi)皮細胞-腫瘤細胞共培養(yǎng)的3-D系統(tǒng)中，腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞之間并沒有直接接觸，加入腫瘤細胞后可以促進血管生成，我們考慮這一作用必定由來自腫瘤細胞的分泌分子介導。報道指出[13]，腫瘤細胞和間質(zhì)細胞分泌產(chǎn)生各種促血管生長因子，如VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)、MCP-1、血管生成素(angiopoietin，Ang)和缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)等，它們通過與相應的受體結(jié)合激活下游信號通路，調(diào)節(jié)腫瘤新生血管生成。VEGF是一種分泌蛋白，是生理和病理性的血管形成中最重要的因子之一，已經(jīng)證實它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中均起到重要作用[14]。在腫瘤微環(huán)境中，VEGF有多種來源，包括腫瘤細胞、炎癥介質(zhì)、血小板和血管細胞[15], 通過內(nèi)皮細胞上兩種高親和力受體酪氨酸激酶VEGFR1(Flt-1)和VEGFR2 / KDR(Flk-1)對腫瘤血管生成的多個方面進行調(diào)節(jié)。MCP-1是促使單核細胞和巨噬細胞到達炎癥區(qū)的化學引誘物，參與多種炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展[16]，是腫瘤的生長、進展和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]；同時MCP-1也是一種有效的血管生成趨化因子。為了探討腫瘤細胞刺激血管生成的機制，在本研究中，我們分別收集了有或無腫瘤細胞刺激的培養(yǎng)上清，用ELISA法檢測上清液中VEFG和MCP-1的水平，結(jié)果在加入腫瘤細胞共培養(yǎng)后，VEGF和MCP-1的水平與內(nèi)皮細胞單獨培養(yǎng)相比顯著增加，即腫瘤細胞刺激后上清液內(nèi)MCP-1以及VEGF水平增高。收集腫瘤細胞刺激后的上清液作為條件培養(yǎng)基, 加入到 HUVECs或SVEC4-10EE2 單獨培養(yǎng)的血管生成系統(tǒng)，結(jié)果顯示CM可以促進內(nèi)皮細胞生成血管，而這一作用可以被CCR2的拮抗劑以及 SU5416 所阻斷。隨后在3-D共培養(yǎng)體系下層培養(yǎng)內(nèi)皮細胞的纖維蛋白凝膠中加入MCP-1、VEGF受體抑制劑SU5416及MCP-1受體CCR2抑制劑。結(jié)果顯示，加入外源性MCP-1后，可顯著促進共軛體系中血管生成；而在加入SU5416及CCR2抑制劑后，HUVECs/MDA-MB-231和SVEC4-10EE2/E0771誘導的血管生成受到了顯著的抑制，證據(jù)支持VEGF和MCP-1參與了體外腫瘤細胞誘導的新生血管生成的過程。

本研究首先建立了一個體外3-D血管生成系統(tǒng)，可以直觀的觀察腫瘤血管生成的情況，為靶向血管治療提供了一個良好的基礎。在此基礎上，腫瘤細胞可以刺激血管生成，初步證實這一現(xiàn)象與腫瘤分泌物MCP-1及VEGF相關(guān)。