HC-1119對三陰性乳腺癌BT549細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

黃 錢， 任秋宇， 張春燕， 何 濤， 甘 淋△

(西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室， 2腫瘤醫(yī)學(xué)研究所, 四川 瀘州 646000)

三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)表達均為陰性的乳腺癌[1]。研究顯示TNBC約占所有新診斷乳腺癌總量的15%～20%，約占每年乳腺癌死亡總數(shù)的5%[2]。TNBC具有惡性程度高、侵襲能力強和復(fù)發(fā)率高的特點，與其它類型的乳腺癌相比，其5年生存率及總生存率更低。故目前TNBC患者均接受標(biāo)準(zhǔn)的多藥輔助化療，但治療效果不佳，約30%～40%的早期TNBC患者會發(fā)生轉(zhuǎn)移，生存周期短[3]。鑒于目前在雌激素受體陽性的乳腺癌中進行靶向治療已取得巨大臨床成功[ 4 ]，有研究提出針對雄激素受體(androgen receptor，AR)陽性的TNBC，將 AR作為其分子靶點進行靶向治療具有一定的可行性[5]。

AR是核受體家族的一員，屬于配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，易被睪酮及其代謝物二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)等雄激素所激活。研究發(fā)現(xiàn)在高達70%～90%的乳腺癌中均可檢測到AR的表達，這使得乳腺癌中AR成為比ER和PR更廣泛的受體[6]，是潛在的治療靶點，為缺乏ER、PR和HER2表達的TNBC的治療提供了新的方向和思路。盡管越來越多的證據(jù)支持雄激素和AR在乳腺癌診斷治療中發(fā)揮一定作用，但其具體機制仍不太清楚，尤其是AR在TNBC中的作用有待深入研究[7-9]。

根據(jù)AR 拮抗劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可將其分為甾體類AR拮抗劑和非甾體類AR 拮抗劑。甾體類AR拮抗劑的代表藥物有醋酸環(huán)丙孕酮，非甾體類雄激素受體拮抗劑種類較多，如氟他胺和比卡魯胺等[10]。HC-1119是一種全新的人工合成的非甾體類AR拮抗劑，前期的細(xì)胞和動物實驗均發(fā)現(xiàn)HC-1119能明顯抑制雄激素受體信號。目前，此化合物已經(jīng)被中國食品藥監(jiān)局批準(zhǔn)作為前列腺治療藥物進入一期臨床實驗，可望成為前列腺癌的治療藥物。

材 料 和 方 法

1 材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、SKBR3、BT549和T47D由西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所惠贈。CCK-8購自日本同仁公司; 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒和Matrigel均購自BD；DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；抗體稀釋液購自北京碧云天公司；抗E-cadherin、vimentin、GAPDH抗體購自Abcam; 抗AR和P21抗體購自CST。

2 方法

2.1細(xì)胞系、細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分組 將BT549細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基中，將MDA-MB-231、T47D、MCF-7和SKBR3細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM高糖培養(yǎng)基中，并添加10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素。將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2的加濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)更換培養(yǎng)基，所有納入研究的細(xì)胞都處于生長對數(shù)期。以適宜濃度的HC-1119刺激細(xì)胞為實驗組(HC-1119組)，相應(yīng)體積DMSO溶劑刺激細(xì)胞為對照(control)組。

2.2Western blot檢測AR、E-cadherin、vimentin、P21和GAPDH的蛋白表達 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度達到90%時，消化裂解細(xì)胞，抽提蛋白質(zhì)。BCA法測定蛋白含量，按35 μg蛋白含量上樣， 10% SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜至0.45 μm聚偏二氟乙烯膜上， 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入抗AR(1∶2 000)、E-cadherin(1∶2 000)、vimentin(1∶2 000)、P21(1∶1 000)和GAPDH(1∶5 000)抗體在4℃下孵育過夜。TBST洗滌3次后，相應(yīng) II 抗(1∶5 000)孵育1 h，洗膜3次后上機掃膜。Image Studio軟件掃描條帶，用Image-Pro Plus軟件進行灰度值測定，將目的蛋白灰度值與內(nèi)參照GAPDH灰度值的相對比值來反映目的蛋白的表達量。

2.3CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的BT549細(xì)胞消化后制備單細(xì)胞懸液，按每孔5 000個細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，24 h細(xì)胞充分貼壁后，用不同濃度(0、10、20、40、80、100和160 μmol/L)的HC-1119刺激細(xì)胞24 h，向每個孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃溫育1.5 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(A)值。計算細(xì)胞活力抑制率(%)=(1-實驗孔平均A值-調(diào)零孔平均A值)/(空白對照孔平均A值-調(diào)零孔平均A值)×100%。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的BT549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，按每孔5×105個細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后分為control組和HC-1119組，給藥，每組3個復(fù)孔，藥物刺激24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，1 200 r/min離心3 min棄上清，用預(yù)冷PBS重懸后1 200 r/min離心3 min棄上清，加300 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL annexin V-FITC混勻，避光室溫孵育15 min，上機前5 min加5 μL PI，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布 取對數(shù)生長期的BT549細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液, 按每孔5×105個細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后分組給藥和收集細(xì)胞同2.4。細(xì)胞加入4 ℃ 70%乙醇，-20 ℃固定24 h。PBS洗滌細(xì)胞2次。每管加入PI試劑液0.5 mL重懸細(xì)胞，37 ℃避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)進行細(xì)胞周期分析。

2.6Transwell實驗 用無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至1 g/L備用。行侵襲實驗時，在Transwell上室內(nèi)加入100 μL稀釋的Matrigel溶液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育4 h。待基質(zhì)膠凝固后，下室加入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基，Transwell上室按每孔2×104個細(xì)胞進行接種。分組(control組和HC-1119組)給藥，每組3個復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)36 h后，用棉簽盡量擦去Transwell小室上室細(xì)胞，75%甲醇固定30 min，PBS清洗2遍，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗2遍，鏡下拍照記錄。行遷移實驗時，除不采用Matrigel進行鋪板，余下步驟同侵襲實驗。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計學(xué)分析軟件為SPSS 20.0。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AR在不同乳腺癌細(xì)胞株中的表達

Western blot結(jié)果顯示，AR在MDA-MB-231和SKBR3細(xì)胞中基本不表達，在MCF-7細(xì)胞中低表達，在人乳腺導(dǎo)管癌T47D細(xì)胞和BT549細(xì)胞中表達水平較高，見圖1。因T47D細(xì)胞還表達PR，MCF-7細(xì)胞還表達ER，故后續(xù)的實驗我們選擇AR高表達的TNBC細(xì)胞株BT549作為研究對象。

Figure 1.AR expression in different breast cancer cell lines. Mean±SD. n=3.

2 AR人工合成拮抗劑HC-1119降低BT549細(xì)胞的活力

用CCK-8法檢測不同濃度(0、10、20、40、80和160 μmol/L) HC-1119作用BT549細(xì)胞24 h對細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)HC-1119呈濃度依賴性抑制BT549細(xì)胞的活力(P<0.05)，計算得出HC-1119的IC50=90.1 μmol/L，故選擇100 μmol/L進行下一步實驗，見圖2A。我們進一步檢測100 μmol/L的HC-1119在24 h、48 h和72 h對BT549細(xì)胞活力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HC-1119呈時間依賴性抑制BT549細(xì)胞的活力(P<0.05)，見圖2B。

Figure 2.The effect of HC-1119 on the viability of BT549 cells. A: the exposure to HC-1119 at different concentrations (0, 10, 20, 40, 80 and 160 μmol/L); B: the exposure to HC-1119 at 100 μmol/L for different time (24 h, 48 h and 72 h). Mean±SD. n=3. *P<0.05, **P<0.01 vs control group.

3 HC-1119對BT549細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)及annexin V/PI雙染法結(jié)果顯示，與control組相比，100 μmol/L的HC-1119能夠明顯促進BT549細(xì)胞早期凋亡(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.HC-1119 inhibits BT549 cell apoptosis. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control group.

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，control組S期細(xì)胞的百分比為(15.86±1.86)%，HC-1119刺激BT549細(xì)胞24 h后S期的百分比顯著增高[(44.2±3.7)%，P<0.01]，提示HC-1119能夠明顯阻滯BT549細(xì)胞于S期，見圖4。

Figure 4.The effects of HC-1119 on BT549 cell cycle distribution. Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group.

4 HC-1119抑制BT549細(xì)胞的遷移和侵襲能力

采用Transwell體外實驗比較100 μmol/L HC-1119對BT549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，實驗結(jié)果表明與control組相比，HC-1119能夠明顯抑制BT549細(xì)胞的遷移和侵襲(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The effects of HC-1119 on the migration and invasion abilities of BT549 cells (×100). Mean±SD. n=3. ** P<0.01 vs control group.

5 Western blot 檢測E-cadherin、vimentin和P21的表達

Western blot結(jié)果顯示,與control組比較，HC-1119作用的BT549細(xì)胞中上皮標(biāo)志分子E-cadherin和間充質(zhì)標(biāo)志分子vimentin表達水平的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性，提示HC-1119不經(jīng)過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)參與細(xì)胞的遷移過程；與control組比較，HC-1119刺激組的P21表達水平明顯降低(P<0.01)，提示HC-1119通過P21參與三陰性乳腺癌細(xì)胞株BT549的細(xì)胞周期調(diào)控，見圖6。

討 論

AR是乳腺癌中表達最廣泛的受體[ 6]，這為AR陽性的TNBC的治療提供了新的研究方向和思路，使AR成為一種潛在的乳腺癌治療靶點。最新研究發(fā)現(xiàn)AR在AR+/ER-的乳腺癌中發(fā)揮重要的致癌作用，故AR拮抗劑能夠抑制乳腺癌細(xì)胞存活和生長[11-13]。目前常用于去勢抵抗性前列腺癌的新一代AR拮抗劑Enzalutamine能夠減少TNBC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14-15]。近來關(guān)于AR拮抗劑用于AR+乳腺癌治療的報告越來越多，研究結(jié)果雖然提示AR拮抗劑可以通過促進細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達來影響細(xì)胞生長，但其具體的分子機制仍不清楚[16]。本文選取新型人工合成AR拮抗劑HC-1119，檢測其對TNBC細(xì)胞BT549功能的影響，并進一步探討其分子機制。

有研究從細(xì)胞水平上證明了AR拮抗劑可以抑制AR+乳腺癌細(xì)胞的生長。Min等[17]通過使用新型AR拮抗劑AZD3514治療乳腺癌時發(fā)現(xiàn)，AZD3514對常見乳腺癌細(xì)胞(包括MDA-MB-157、MDA-MB-231、BT-549、HCC70、HCC1143、Hs578T、MDA-MB-453、MDA-MB-468、BT-474、MCF7、T47D和 SKBR3)均具有較輕微的抗增殖作用，但是這種抗增殖與AR的表達水平無關(guān)，而是通過下調(diào)DNA損傷應(yīng)答(DNA damage response，DDR)分子的表達而發(fā)揮作用，這些結(jié)果為AR抑制劑AZD3514治療AR+的乳腺癌提供了初步的分子機制基礎(chǔ)。大量的臨床實驗也證明了AR拮抗劑可以提高AR+的乳腺癌病人的生存率。Kensler等[18]對4 147例浸潤性乳腺癌患者進行了平均16.5年的隨訪調(diào)研，發(fā)現(xiàn)AR的表達與ER+腫瘤的預(yù)后改善相關(guān)。另有一項II期臨床試驗也發(fā)現(xiàn)：在局部晚期或轉(zhuǎn)移性的AR陽性的TNBC患者中，Enzalutamide具有臨床療效，且安全性良好，提示Enzalutamide可能是一種晚期TNBC患者的有效藥物[19]。本研究表明AR的新型拮抗劑HC-1119呈濃度依賴和時間依賴性地抑制BT549細(xì)胞活性，且明顯促進細(xì)胞的早期凋亡率，提示HC-1119能通過抑制AR的表達降低TNBC細(xì)胞株BT539的細(xì)胞增殖能力。這個結(jié)論我們進一步通過細(xì)胞周期的檢測得以驗證，HC-1119可以顯著阻滯BT549細(xì)胞于S期。有趣的是，另有文獻報道Enzalutamide雖然能夠抑制BT549細(xì)胞活性，但是它并不能促進細(xì)胞早期凋亡，也不會改變細(xì)胞周期分布[15]。我們考慮這可能與不同AR拮抗劑的分子機制不同有關(guān)。

目前普遍認(rèn)為抑癌基因p21的正常功能是通過停滯細(xì)胞周期，阻斷細(xì)胞分裂，有利于基因組的損傷后修復(fù)。且大量文獻報道，抗腫瘤藥物可通過增加P21的表達而促進乳腺癌細(xì)胞凋亡，證實了P21在抗腫瘤中的重要作用[ 20-21]。我們進一步探討HC-1119抑制BT549細(xì)胞增殖的分子機制時卻發(fā)現(xiàn)，HC-1119可能通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P21的表達，明顯增加S期細(xì)胞的比例，抑制細(xì)胞的活力，促進細(xì)胞凋亡，這與上述P21經(jīng)典機制并不一樣。我們考慮這可能與我們選擇的細(xì)胞系有關(guān)，本實驗選擇的BT549是一株特殊的P53缺失的人乳腺癌細(xì)胞株。有文獻報道在P53受損或缺失的細(xì)胞中，當(dāng)P21在細(xì)胞質(zhì)富集時，可使細(xì)胞株獲得一定的致癌特性，進而顯著促進細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞遷移[22-23]。這就較好地解釋了我們的實驗結(jié)果與常規(guī)結(jié)論不一致的原因。

此外我們還發(fā)現(xiàn)HC-1119還能夠明顯降低BT549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。但是，當(dāng)我們進一步研究其細(xì)胞侵襲分子機制時，卻發(fā)現(xiàn)作為侵襲的關(guān)鍵步驟EMT的分子標(biāo)志物E-cadherin和vimentin在control組和實驗組的變化趨勢并不明顯，提示HC-1119不是通過EMT過程抑制BT549的侵襲轉(zhuǎn)移。至于HC-1119如何調(diào)控三陰性乳腺癌細(xì)胞BT549的侵襲和轉(zhuǎn)移，尚有待進一步研究。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)新型人工AR拮抗劑HC-1119能夠通過P21的表達降低抑制AR陽性的TNBC細(xì)胞BT549的細(xì)胞活力，且不通過EMT過程抑制侵襲和遷移能力，提示HC-1119可能成為AR陽性表達的TNBC的一種潛在的有效的治療藥物。