NOD8抑制人胰腺癌細(xì)胞自噬及凋亡對(duì)其自噬作用的影響*

梁若龍， 曾 琪， 王晗月， 胡巢鳳△， 羅 森△

(1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系， 國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510632; 2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 江西 贛州 341000)

自噬是溶酶體依賴性的以細(xì)胞質(zhì)空泡化為特點(diǎn)的降解過程，外界因素刺激如饑餓、缺氧等可誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，致細(xì)胞形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體膜，膜內(nèi)包裹需要消化的物質(zhì)，然后運(yùn)送至溶酶體消化[1]。自噬過程與細(xì)胞死亡相關(guān)，適量的自噬有可刺激促進(jìn)細(xì)胞存活，而過量的自噬則可加速細(xì)胞的死亡，維持細(xì)胞內(nèi)的生理平衡。

NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)家族是胞質(zhì)蛋白，具有識(shí)別病原體相關(guān)分子模式的能力，抵抗病原微生物的入侵[2]，其家族中最有代表性的成員是NOD1和NOD2，通過受體相互作用蛋白2(receptor-interacting protein 2，Rip2)識(shí)別細(xì)菌肽聚糖的降解產(chǎn)物，進(jìn)而激活NF-κB，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[3]。近年來文獻(xiàn)報(bào)道NLRs家族中也具有抑制炎癥反應(yīng)的成員，如NOD8(也稱為NLRP10或PYNOD),研究發(fā)現(xiàn)NOD8在體外和體內(nèi)都可發(fā)揮抗炎效應(yīng)[4]。我們前期研究證實(shí)，NOD8可抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞NO與IL-1β釋放,其作用機(jī)制可能與NOD8抑制caspase-1及NF-κB的活化有關(guān)[5]。此外，NOD8可抑制H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞細(xì)胞凋亡[6]。根據(jù)目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，NOD8主要發(fā)揮抗炎和抗凋亡效應(yīng)。那么，過表達(dá)NOD8是否能抑制自噬以及凋亡是否影響NOD8對(duì)自噬的作用至今未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究過表達(dá)NOD8對(duì)Panc-1細(xì)胞自噬的作用及其可能機(jī)制；并進(jìn)一步探討凋亡對(duì)NOD8調(diào)控自噬作用的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)。pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室組構(gòu)建；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco；轉(zhuǎn)染試劑JetPRIME為Polyplus產(chǎn)品；兔抗人NOD8抗體購自Santa Cruz；抗GAPDH、抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)、beclin-1、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p-Akt、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及p-mTOR抗體均購于CST；caspase抑制劑Z-VAD-FMK購自MedChemExpress；免疫熒光染色試劑盒-兔抗Cy3購于碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 用10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)Panc-1細(xì)胞，同時(shí)加入1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素，每孔3×105個(gè)細(xì)胞加入6孔板中，總液體量為2 mL，將培養(yǎng)板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為5% CO2，37℃，第2天進(jìn)行空質(zhì)粒和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。在研究過表達(dá)NOD8是否抑制細(xì)胞發(fā)生自噬實(shí)驗(yàn)中，分為對(duì)照(control)組：DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，不做任何處理；pEGFP-C2空質(zhì)粒(pEGFP-C2)組：轉(zhuǎn)染pEGFP-C2空質(zhì)粒6 h后，去除培養(yǎng)基，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)42 h；pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒(pEGFP-NOD8)組：轉(zhuǎn)染pEGFP-RNOD8重組質(zhì)粒6 h后，吸去培養(yǎng)基，添加新鮮的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)42 h。在探討凋亡對(duì)NOD8調(diào)控自噬作用的影響實(shí)驗(yàn)中，分為對(duì)照組；pEGFP-C2空質(zhì)粒組；pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒；pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒+Z-VAD-FMK(pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK)組：轉(zhuǎn)染pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒6 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)基，加入Z-VAD-FMK(10 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)42 h。本課題組前期實(shí)驗(yàn)確定Z-VAD-FMK的最佳劑量為10 μmol/L，該劑量不影響細(xì)胞活性，并可有效抑制細(xì)胞凋亡。

2.2Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 清除6孔培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，加入含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心、收集細(xì)胞，將RIPA裂解液100 μL和1 μL PMSF蛋白酶抑制劑混合液加入至細(xì)胞沉淀中，移液槍吹打使細(xì)胞均勻懸浮，置于冰上孵育，時(shí)間為30 min，裂解結(jié)束后于4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,將上清轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)；提取蛋白后, 用BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白的濃度；用SDS-PAGE分離蛋白后，根據(jù)蛋白分子量的大小用不同的轉(zhuǎn)膜條件將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再置于封閉液中封閉1 h；加入Ⅰ抗體，并于4℃冰箱孵育12～16 h；加Ⅱ抗，室溫孵育1 h；用TBST洗膜，ECL發(fā)光顯影，GAPDH 作為內(nèi)參照，用灰度分析軟件進(jìn)行分析。

2.3免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞LC3斑點(diǎn)形成 將蓋玻片置于6孔板內(nèi)，按照上述方法培養(yǎng)細(xì)胞，并轉(zhuǎn)染質(zhì)粒；去上清，用固定液固定細(xì)胞10 min；去固定液，用洗滌液洗3次；再置于密封液中封閉1 h，加Ⅰ抗(LC3抗體)，置于4℃過夜，洗滌液洗3次；加入Cy3熒光標(biāo)記的Ⅱ抗室溫避光孵育1 h；洗滌液洗3次；DAPI 染色液室溫避光染色；加抗猝滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察LC3斑點(diǎn)形成情況并拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用Bonferroni分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后NOD8蛋白的表達(dá)

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Panc-1細(xì)胞48 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-NOD8組細(xì)胞NOD8蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.01)，見圖1。這說明pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)NOD8蛋白表達(dá)水平。

Figure 1.Expression of the NOD8 protein level in Panc-1 cells in different groups. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control or pEGFP-C2 group.

2 NOD8對(duì)LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-NOD8組細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)，而對(duì)照組和pEGFP-C2組比較，beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

Figure 2.The effect of NOD8 on the expression of LC3-Ⅱand beclin-1 proteins in the cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control or pEGFP-C2 group.

3 免疫熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞LC3斑點(diǎn)形成

自噬小體形成過程中，胞漿型LC3即LC3-I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば蚅C3，即LC3-II，形成結(jié)合在自噬小體膜上的斑點(diǎn)狀LC3-Ⅱ。Cy3是一種紅色熒光探針，紅色熒光斑點(diǎn)增多，說明細(xì)胞自噬小體形成增多。免疫熒光染色結(jié)果顯示：對(duì)照組和pEGFP-C2組細(xì)胞內(nèi)均可見一定數(shù)量紅色熒光LC3斑點(diǎn)形成；而EGFP-NOD8組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光斑點(diǎn)明顯少于對(duì)照組和pEGFP-C2組，見圖3。這一結(jié)果表明NOD8可抑制細(xì)胞自噬。

Figure 3.The number of LC3 spots in the cells observed by fluorescence microscopy (×200).

4 NOD8對(duì)PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-NOD8組細(xì)胞p-Akt和p-mTOR蛋白表達(dá)水平上升；而3組總Akt和mTOR蛋白表達(dá)未見明顯變化，見圖4。以上結(jié)果表明，NOD8可激活PI3K/Akt/mTOR通路。

Figure 4.The effect of NOD8 on the expression of the p-Akt and p-mTOR proteins in the cells. Mean±SD.n=3. **P<0.01 vs control or pEGFP-C2 group.

5 Z-VAD-FMK對(duì)NOD8抑制細(xì)胞自噬的影響

5.1Z-VAD-FMK增加過表達(dá)NOD8細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白水平 我們前期的實(shí)驗(yàn)證實(shí)單獨(dú)應(yīng)用Z-VAD-FMK不影響Panc-1細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)(待發(fā)表)。本結(jié)果顯示：與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-NOD8組細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)減少(P<0.01)；而pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK組細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)水平升高，與pEGFP-NOD8組比較(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.The effect of Z-VAD-FMK on the expression of LC3-Ⅱ and beclin-1 proteins in the NOD8-overexpressing cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs control and pEGFP-C2 group; △△P<0.01 vs pEGFP-NOD8 group.

5.2Z-VAD-FMK增加過表達(dá)NOD8細(xì)胞LC3斑點(diǎn)形成 如圖6所示，pEGFP-NOD8組細(xì)胞LC3斑點(diǎn)形成明顯少于對(duì)照組和pEGFP-C2組；而pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK組細(xì)胞LC3斑點(diǎn)數(shù)顯著高于其它3組，即Z-VAD-FMK可逆轉(zhuǎn)NOD8抑制自噬小體的形成。

Figure 6.The number of LC3 spots in the cells detected by fluorescence microscopy (×200).

討 論

生理或者病理狀態(tài)下，自噬小體可以包裹細(xì)胞中多余或者受損的成分，輸送到溶酶體降解后重新合成自身需要的物質(zhì)，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)基因缺失或突變時(shí)，腫瘤發(fā)生率增加，說明自噬可抑制腫瘤發(fā)生[7]。而腫瘤細(xì)胞在缺氧狀態(tài)，缺乏葡萄糖和氨基酸狀態(tài)時(shí)，可誘發(fā)自噬，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[8]。因此，自噬在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著雙重的調(diào)節(jié)作用。

LC3 前體形成后, C 末端被自Atg4水解，切割掉一段多肽后暴露出甘氨酸, 即生成LC3-I，分布在胞漿；隨后LC3-I被Atg7激活，LC3-Ⅰ由磷脂酰乙醇胺脂化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ位于自噬體膜上，與自噬體數(shù)量呈正相關(guān)，是公認(rèn)的自噬體標(biāo)記蛋白[9]。Beclin-1是自噬形成的必需蛋白，可與多種蛋白反應(yīng)并調(diào)控自噬體形成和成熟。Beclin-1可活化Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶，即VPS34，產(chǎn)生磷脂酰肌醇3磷酸,廣泛參與自噬體的形成[10]。

NLRs家族中很多成員可識(shí)別各種病原體相關(guān)分子模式，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，發(fā)揮天然免疫作用。NOD8是NLRs家族中的成員之一，文獻(xiàn)報(bào)道其具有抗炎和抑制凋亡作用。那么，NOD8是否對(duì)自噬有影響？本研究將pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Panc-1細(xì)胞，用Western blot檢測(cè)各組Panc-1細(xì)胞NOD8蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明：pEGFP-NOD8組細(xì)胞NOD8蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組和pEGFP-C2組，說明pEGFP-NOD8重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并上調(diào)細(xì)胞內(nèi)NOD8蛋白的表達(dá)水平。此外，研究發(fā)現(xiàn)pEGFP-NOD8組細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和pEGFP-C2組。以上結(jié)果表明，過表達(dá)NOD8可抑制細(xì)胞自噬。

免疫熒光法是檢測(cè)自噬的重要指標(biāo)，自噬活化的過程中, 位于胞漿的LC3-I與磷脂酰乙醇胺結(jié)合轉(zhuǎn)化為 LC3-II, 隨后LC3-II結(jié)合到自噬小體膜上。LC3-I 轉(zhuǎn)變?yōu)?LC3-II表現(xiàn)在胞漿中彌散分布的 LC3 變?yōu)榘唿c(diǎn)狀聚集。本研究用免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組和pEGFP-C2組細(xì)胞內(nèi)均可見一定數(shù)量的LC3斑點(diǎn)；而pEGFP-NOD8組細(xì)胞內(nèi)LC3斑點(diǎn)數(shù)量明顯少于對(duì)照組和pEGFP-C2組。以上結(jié)果進(jìn)一步說明NOD8可抑制細(xì)胞自噬。

有許多信號(hào)通路參與了自噬的調(diào)節(jié)，其中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在自噬的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。mTOR本質(zhì)上屬于非典型絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其對(duì)自噬具有負(fù)調(diào)節(jié)功能。酪氨酸激酶受體在相關(guān)信號(hào)刺激后激活，進(jìn)而使Ⅰ型磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)激活，從而催化磷脂酰肌醇4,5二磷酸，使其轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)，PIP3結(jié)合胞內(nèi)信號(hào)蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(phosphoinositide-dependent kinase-1,PDK-1)，PDK-1促使Akt活化，進(jìn)而激活mTOR，抑制自噬[11]。

為探討NOD8抑制自噬是否與PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)，我們檢測(cè)了總AKT、p-AKT、總mTOR和p-mTOR蛋白表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-NOD8組細(xì)胞p-AKT及p-mTOR蛋白表達(dá)量顯著上升，而各組細(xì)胞總AKT和mTOR蛋白表達(dá)無明顯差異。這說明NOD8抑制細(xì)胞自噬可能與激活PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)。

凋亡對(duì)自噬的影響錯(cuò)綜復(fù)雜，凋亡可促進(jìn)自噬，也可拮抗自噬，凋亡和自噬也可相互合作并可同時(shí)發(fā)生[12]。為研究凋亡是否影響NOD8對(duì)自噬的調(diào)控作用，我們應(yīng)用Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組和pEGFP-C2組相比，pEGFP-NOD8組細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)明顯減少；而與pEGFP-NOD8組比較，pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK組細(xì)胞LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白表達(dá)水平顯著升高。此外，我們還應(yīng)用免疫熒光染色檢測(cè)LC3斑點(diǎn)形成情況。結(jié)果顯示，pEGFP-NOD8組細(xì)胞內(nèi)LC3斑點(diǎn)形成數(shù)量明顯少于對(duì)照組和pEGFP-C2組；而pEGFP-NOD8+Z-VAD-FMK組細(xì)胞內(nèi)LC3斑點(diǎn)數(shù)量明顯增加。這表明Z-VAD-FMK可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)NOD8抑制細(xì)胞自噬的效應(yīng)。以上結(jié)果證實(shí)凋亡可增強(qiáng)NOD8對(duì)自噬的抑制作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NOD8可抑制胰腺癌細(xì)胞自噬；其機(jī)制可能與激活PI3K/Akt/mTOR通路有關(guān)。而抑制凋亡后，可逆轉(zhuǎn)這一效應(yīng)，表現(xiàn)為自噬上調(diào),說明凋亡可增強(qiáng)NOD8對(duì)自噬的抑制作用，即凋亡對(duì)NOD8抑制自噬具有協(xié)同作用。本研究結(jié)果將為臨床胰腺癌和其它腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。