瓊玉膏對胰腺癌小鼠化療增效減毒作用研究*

劉 麗， 劉大晟， 李震東， 李接興， 吳先林

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院校門診部， 廣東 廣州 510632； 2廣東省中醫(yī)院血管甲狀腺科， 廣東 廣州 510120；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 3肝膽外科， 4中西醫(yī)結(jié)合胰腺病診治中心， 5中心實驗室， 廣東 廣州 510632)

胰腺癌的5年生存率僅為5%，發(fā)病率與死亡率非常接近[1-2]。目前，治療胰腺癌的主要方法是早期診斷手術(shù)治療，但即使是切緣陰性、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，術(shù)后仍可能出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，最常見的是肝轉(zhuǎn)移等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且80%的胰腺癌患者確診時已失去手術(shù)切除的時機。吉西他濱(gemcitabine)是近20年來胰腺癌化療的代表藥物，然而其可能帶來的嚴(yán)重毒副作用，足以抵消其治療效果，且總體生存率幾乎沒有改善[2]。其它治療如放療、內(nèi)鏡治療及生物治療等，各有其局限性，給胰腺癌的治療帶來了困境。因此，尋找能夠更有效地治療胰腺癌或改善吉西他濱毒副作用的聯(lián)合輔助治療藥物具有重要的意義。

因胰腺特殊的解剖部位和獨特的生理功能，胰腺癌相當(dāng)于中醫(yī)學(xué)“癥瘕”、“積聚”和“黃疸”等病癥。中醫(yī)對于胰腺癌的治療進(jìn)行了長期的臨床實踐，觀察到患者在表現(xiàn)為氣陰虧虛、脾虛氣滯等證候，治療上宜采用“益氣養(yǎng)陰”法為主[3]。瓊玉膏(Qiangyugao)是“益氣養(yǎng)陰”代表方，并可健脾養(yǎng)血。前期的研究表明，瓊玉膏能增強化療藥物抑制肺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的作用，可改善肺癌化療后小鼠的骨髓抑制情況，減緩腫瘤的生長，并能抑制HbxAg的表達(dá)，防治原發(fā)性肝癌，有可能成為一種能應(yīng)用于臨床抗腫瘤的輔助用藥[4-6]。本項工作建立胰腺癌小鼠移植瘤模型，觀察瓊玉膏對胰腺癌小鼠吉西他濱化療的增效減毒作用，并探討其可能的作用機制。

材 料 和 方 法

1 動物與分組

SPF級C57BL/6小鼠50 只，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量 (20±2)g，購自廣東醫(yī)學(xué)實驗動物中心，動物合格證編號為SCXK(粵)2017-0012，常規(guī)飼養(yǎng)于暨南大學(xué)動物實驗中心。將小鼠隨機分為5組，每組雌雄各半，即正常(normal)組、模型(model)組、吉西他濱治療(gemcitabine)組、瓊玉膏治療(Qiongyugao)組和聯(lián)合治療(combination)組，每組10 只。

2 藥品制備

瓊玉膏由本課題組自行配制，生地黃，茯苓和人參 (批號依次為：HX18ED1，HX18C01和HX18B01，廣東和翔制藥有限公司；蜂蜜 (批號：GB14963，北京同仁堂有限公司)。取生地黃 500 g、茯苓100 g、人參50 g，文火水提 2次，每次2 h，合并濾液，靜置后取上清液，水浴濃縮為相對密度 1.21～1.25的原液1 000 mL 備用；蜂蜜350 mL煉至中蜜，取原液 1 000 mL加入煉蜜 350 mL，繼續(xù)濃縮至1 000 mL，收膏過濾，于80 ℃測比重為 1.40 kg/L，即成瓊玉膏。吉西他濱每支200 mg (批號：180707)，由江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，購于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院西藥房，使用前每支予以生理鹽水10 mL稀釋。

3 細(xì)胞、主要試劑與儀器

胰腺癌Panc02細(xì)胞購自ATCC(American Type Culture Collection)。胎牛血清及DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco;糖鏈抗原19-9(carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)的酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；流式檢測試劑盒購自BD；Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液購自GE。全自動血細(xì)胞分析儀購自邁瑞公司。

4 方法

4.1瘤液制備和模型建立 胰腺癌Panc02細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，取生長良好的細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞密度調(diào)至1×1010/L，取0.2 mL單細(xì)胞懸液，皮下接種于模型組和各治療組小鼠腋窩處，建立胰腺癌小鼠移植瘤模型；對照組小鼠予以生理鹽水0.2 mL皮下接種于腋窩處。

4.2給藥方法 造模14 d后，模擬臨床胰腺癌患者給藥方式，吉西他濱組予以吉西他濱腹腔注射，每天2次，劑量為100 mg·kg-1·d-1；瓊玉膏組予以瓊玉膏灌胃治療，每天2次，劑量為 14 g·kg-1·d-1；聯(lián)合治療組參考吉西他濱組和瓊玉膏組給藥方法，同時予以瓊玉膏和吉西他濱治療；對照組和模型組參考聯(lián)合治療組的給藥方法，分別予以等量生理鹽水腹腔注射和灌胃，以上各組均連續(xù)給藥干預(yù)21 d。

4.3取材與指標(biāo)檢測 小鼠造模后，每5 d測量一次腫瘤大小并繪制瘤體體積變化圖。治療21 d后，無菌條件下摘眼球取血0.8～1 mL后處死小鼠，取胰腺和腋窩下瘤體組織，瘤體組織稱重。

血常規(guī)檢測：取各組小鼠血液，應(yīng)用全自動血細(xì)胞分析儀 (型號BC-5390)通過電阻抗法檢測白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞 (red blood cell，RBC)和血小板 (platelet，PLT)計數(shù)及血紅蛋白 (hemoglobin，HGB)含量。

ELISA檢測：將腫瘤組織取下后充分研磨，4 ℃、1 800×g離心15 min，取上清，采用ELISA法檢測樣本中CEA及CA19-9水平，于酶標(biāo)儀上讀取樣品各孔的吸光度(A)值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度。

流式細(xì)胞學(xué)檢測：將各組小鼠血液用等量生理鹽水稀釋后鋪加于Ficoll-Paque淋巴細(xì)胞分離液的液面上并進(jìn)行離心，分層后吸取外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)，洗滌后重懸于相應(yīng)的培養(yǎng)液中。將培養(yǎng)足夠時間的PBMC從培養(yǎng)箱中取出，細(xì)胞原液調(diào)整為每100 μL含約106個細(xì)胞，加入針對CD4細(xì)胞表面抗原的anti-mouse CD4單克隆抗體染色，細(xì)胞固定和破膜后，加入1 mL的Perm/Wash buffer沖洗淋巴細(xì)胞，配成終體積為100 μL的淋巴細(xì)胞液，在其中分別加入所需檢測的單克隆抗體anti-mouse IFN-γ、anti-mouse IL-4 APC、anti-mouse IL-17APE和anti-mouse Foxp3 APC，然后在4 ℃環(huán)境下避光孵育30 min，渦旋混合均勻，使用1 mL PBS進(jìn)行洗滌，離心后加入200 μL PBS，重懸待測，流式細(xì)胞儀計數(shù)。

5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。瘤體曲線的組間比較采用雙因素方差分析(two-way ANOVA)，其它指標(biāo)的組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠瘤體體積

模型組和各治療組小鼠皮下接種Panc02細(xì)胞后，瘤體不斷增長(P<0.01)。給予藥物治療后，與模型組比較，3個治療組小鼠瘤體增長緩慢，(P<0.05，P<0.05),見圖1。

Figure 1.Tumor growth curve of mice in each group after modeling. Mean±SD. n=10.**P<0.01 vs normal group; #P<0.05， ## P<0.01 vs model group.

2 小鼠的體重和瘤重

小鼠成瘤后的整體觀察及剝離后的瘤體照片如圖2所示。造模后，小鼠體重較正常組均有下降；治療21 d后，吉西他濱治療組小鼠體重下降趨勢最為顯著，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.05)，見圖3A。模型組小鼠瘤重水平較正常組顯著升高 (P<0.01)；模型組小鼠瘤重水平與瓊玉膏治療組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，與其它2個治療組比較，差異顯著(P<0.01)，見圖3B。

Figure 3.Comparison of body weight (A) and tumor weight (B) of mice in each group. Mean ± SD. n=10. *P<0.05,**P<0.01 vs normal group; #P<0.05, ## P<0.01 vs model group.

3 血常規(guī)

治療21 d后，模型組小鼠WBC、RBC和PLT計數(shù)及 HGB含量與正常組比較均有顯著下降 (P<0.01);與模型組比較，吉西他濱治療組小鼠的WBC、RBC和PLT計數(shù)及HGB含量均下降(P<0.05，P<0.01)；瓊玉膏治療組小鼠的WBC、RBC和PLT計數(shù)及HGB含量均有升高，其中WBC和HGB的比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；聯(lián)合治療組小鼠的HGB含量顯著升高(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.Comparison of blood routines of mice in each group. A: comparison of WBC counts; B: comparison of HGB contents; C: comparison of RBC counts; D: comparison of PLT contents. Mean±SD. n=10.**P<0.01 vs normal group; #P<0.05，## P<0.01 vs model group.

4 ELISA檢測血清腫瘤標(biāo)志物

與正常組相比，模型組小鼠血清的CA19-9和CEA濃度顯著升高 (P<0.01)；治療后，與模型組相比，3個治療組的CA19-9和CEA濃度均有下降 (P<0.05)，以吉西他濱治療組和聯(lián)合治療組表現(xiàn)較為顯著(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.Comparison of tumor markers of mice in each group. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs normal group; #P<0.05, ## P<0.01 vs model group.

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周Th1/Th2和Th17/Treg的表達(dá)

胰腺癌小鼠造模后，Th1和Th17細(xì)胞的陽性表達(dá)率升高，而Th2和Treg細(xì)胞陽性表達(dá)率降低。與空白組相比，模型組小鼠的Th1/Th2和Th17/Treg比例顯著上升(P<0.01)；給予藥物干預(yù)后，瓊玉膏治療組和聯(lián)合治療組Th1/Th2和Th17/Treg比例較模型組比較均顯著下降(P<0.01)；給予吉西他濱治療后，與模型組相比，小鼠的Th1、Th2、Th17和Treg陽性表達(dá)率被抑制。吉西他濱治療組Th1/Th2比值較模型組顯著降低(P<0.01)，Th17/Treg比值較模型組顯著升高(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.Comparison of Th1/Th2 and Th17/Treg of mice in each group. Mean±SD. n=10. **P<0.01 vs normal group; ##P<0.01 vs model group.

討 論

吉西他濱是一種胞嘧啶核苷衍生物，通過抑制核糖核苷酸還原酶和競爭性插入 DNA 鏈中脫氧胞苷的位點導(dǎo)致 DNA 鏈斷裂，使細(xì)胞阻滯在G1/S期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用，但有明顯的骨髓抑制作用。本研究表明，吉西他濱干預(yù)組小鼠瘤體大小及腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)較模型組顯著降低，且小鼠血細(xì)胞計數(shù)顯著減少。盡管吉西他濱化療是晚期胰腺癌的主要治療方法，其作為胰腺癌患者的化療藥物被批準(zhǔn)主要是因為疾病相關(guān)癥狀的改善，但其骨髓抑制等副作用也不可忽視[7-9]。研究表明，將化療藥物與中藥聯(lián)合治療能降低化療藥物的毒副反應(yīng)，并提高化療藥物的療效[10-12]。本研究通過對胰腺癌小鼠模型分別給予吉西他濱、瓊玉膏和吉西他濱聯(lián)合瓊玉膏治療，結(jié)果顯示瓊玉膏可減緩瘤體的增長，降低腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)，增加WBC、RBC和PLT計數(shù)及HGB含量，并可降低Th1/Th2和Th17/Treg比例，從而發(fā)揮其免疫調(diào)控作用。

中醫(yī)理論認(rèn)為，胰腺癌的發(fā)生是臟腑氣血陰陽失調(diào)，正氣虛損，外邪內(nèi)侵，積漸而成。而胰腺癌患者化療后，更易出現(xiàn)神疲乏力、腹痛納差、氣短口干等氣陰兩虧、脾虛氣滯之證。本實驗中瓊玉膏由人參、生地黃、茯苓和蜂蜜四藥相伍而成。方中生地黃益氣滋陰，人參健脾養(yǎng)血、扶正祛邪，茯苓健脾除濕行氣，蜂蜜味甘性潤，四藥合用有補有通，有開有闔，補而不滯，滋而不膩，補陰而不忘扶陽，益氣而不忘育陰養(yǎng)血，共奏調(diào)節(jié)氣血陰陽平衡之效。機體陰陽平衡，則正勝邪退，疾病向愈，機體免疫功能恢復(fù)，T細(xì)胞亞群比例平衡。有研究顯示，瓊玉膏中四味藥均可調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡，顯著改變Th17/Treg細(xì)胞的計數(shù)和比例[13-14]，并可通過增加CD4+和CD8+T細(xì)胞比率，調(diào)節(jié)T細(xì)胞平衡[15-16]。

T細(xì)胞亞群是腫瘤免疫的重要組成部分。Th1/Th2和Th17/Treg等互相拮抗，處于動態(tài)平衡，調(diào)節(jié)機體免疫。近年來研究表明，Th1細(xì)胞被認(rèn)為是參與腫瘤免疫激活的主要細(xì)胞群；Th2細(xì)胞為腫瘤免疫逃逸提供重要條件，能阻滯Th1類細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答[17]；Th17細(xì)胞在腫瘤免疫中可能具有雙重作用，一方面可能促進(jìn)腫瘤血管生長和細(xì)胞增殖，另一方面又通過介導(dǎo)免疫反應(yīng)等發(fā)揮抗腫瘤作用[18]；Treg細(xì)胞作為淋巴細(xì)胞亞群在腫瘤進(jìn)展中可抑制免疫反應(yīng)，發(fā)揮維持機體免疫穩(wěn)態(tài)和介導(dǎo)外周耐受的關(guān)鍵作用[19]。

本研究證實，盡管瓊玉膏單獨治療胰腺癌的療效較弱，對瘤體的抑制及腫瘤標(biāo)志物的下調(diào)不如吉西他濱治療組顯著，但瓊玉膏與吉西他濱聯(lián)合用藥的情況下，能通過降低Th1/Th2和Th17/Treg比例來調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡，增加WBC、RBC和PLT計數(shù)和HGB含量，對吉西他濱的化療起到增效減毒的作用。因此，我們推測瓊玉膏可通過誘導(dǎo)CD4+T 細(xì)胞分化調(diào)控Th1/Th2和Th17/Treg的比值來調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群平衡，并增加WBC、RBC和PLT計數(shù)和HGB含量，降低腫瘤標(biāo)志物水平，減緩瘤體的增長，從而減緩胰腺癌的發(fā)展。