miR-17對大鼠血管平滑肌細胞衰老的調控作用

李書國， 劉菊菊， 葉 明， 鄧娟娟， 張 丹， 彭 艷

(三峽大學老年醫(yī)學研究所&宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科， 湖北 宜昌 443003)

細胞衰老是細胞在外界環(huán)境改變或內部特定基因表達變化等因素作用下喪失增殖能力后進入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)[1]。細胞衰老是一種正常的生理機制，也是一個動態(tài)的過程，其可以引起組織修復能力減弱，還通過分泌衰老相關分泌表型因子[2]，參與細胞增殖、凋亡、炎癥反應和上皮間質轉化等，與糖尿病、動脈粥樣硬化、骨質疏松和神經(jīng)退化性疾病等慢性疾病有關[3]。研究表明，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)衰老在動脈粥樣硬化發(fā)生機制中起著重要作用[4-5]，因此，VSMCs衰老的調控可能成為未來動脈粥樣硬化防治的靶點。

近年來研究發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNAs，miRNAs)在細胞衰老過程中有重要的作用，參與細胞衰老的miRNAs包括miRNA-15、17、29、34、217和885等[6-9]，其中miR-17可以抑制細胞老化，促進細胞增殖[10]。本實驗以大鼠血管平滑肌細胞為研究對象，采用化學修飾方法探討miR-17對VSMCs衰老的影響及機制，以了解miR-17可能在VSMCs衰老調控中的潛在作用。

材 料 和 方 法

1 實驗動物及主要試劑

10只雄性Sprague-Dawley(SD)清潔級大鼠，6周齡，體重150～200 g，由三峽大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。DMEM培養(yǎng)液購自Sigma；p16和p21單克隆抗體購自Santa Cruz。D-半乳糖和β-半乳糖苷酶染色試劑購自上海阿拉丁生化公司；逆轉錄及PCR反應試劑盒購自Gene Copoeia。

2 方法

2.1大鼠胸主動脈VSMCs體外培養(yǎng)與分組 采用頸椎脫位法處死大鼠。無菌條件下剪開大鼠皮膚，分離胸主動脈，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)VSMCs。用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細胞，待細胞生長至完全匯合后傳代培養(yǎng)，獲得純度98%以上的VSMCs，取3～6代VSMCs用于后續(xù)實驗。采用免疫熒光方法鑒定VSMCs。細胞隨機分為6組：誘導衰老+miR-17過表達(aging induction+miR-17 mimics, A-miR-17)組、誘導衰老+miR-17敲減(aging induction+miR-17 inhibitor, A-anti-miR-17)組、誘導衰老對照(A-control)組、正常培養(yǎng)+miR-17 mimics (normal+miR-17 mimics, N-miR-17)組、N-anti-miR-17組和N-control組。取處于對數(shù)生長期的細胞采用脂質體轉染的方式將miR-17-mimics和miR-17-inhibitor導入相應的過表達或敲減組，24 h后加入D-半乳糖(10 g/L)誘導細胞衰老，正常培養(yǎng)組則加常規(guī)培養(yǎng)液。

2.2脂質體轉染 取生長狀態(tài)良好的VSMCs，轉染前1天將細胞接種于6孔板， 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；轉染前2 h換成無血清DMEM培養(yǎng)液。每個培養(yǎng)孔加轉染混合液1 mL，并前后輕輕搖動細胞培養(yǎng)板使混合液與培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液混勻；細胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h后吸出混合液換入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3β-半乳糖苷酶染色 各組細胞衰老檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作。吸出細胞培養(yǎng)液，清洗液清洗1次，加入β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫靜置5 min后吸出固定液，加入適量酸性液(pH 6.0)，10 min后吸出酸性液，加入預熱的染色工作液，置入37 ℃、無CO2的培養(yǎng)箱，孵育3～16 h后光學顯微鏡下觀察并攝片。計數(shù)藍染的細胞為陽性細胞，每次隨機選取3個視野，計數(shù)100個細胞，衰老細胞陽性率(%)=衰老細胞數(shù)/100個細胞×100%，每組實驗重復3次。

2.4RT-qPCR檢測相關基因的表達 采用RT-qPCR檢測各組細胞不同時期miR-17和衰老相關基因的表達情況。提取細胞總RNA合成cDNA，構建合適的反應體系，反應條件：25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min； RT-qPCR檢測：50 ℃ 2 min, 95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，重復40個循環(huán)；70 ℃～90 ℃繪制熔解曲線。每個樣本檢測3次，p16和p21以GAPDH為內參照，miR-17以U6為內參照，采用2-ΔΔCt方法進行評估，分析目的基因的表達。引物由北京擎科生物技術有限公司合成，序列如下：miR-17(擴增長度為248 bp，Tm=56 ℃)：上游引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTACCTGC-3′，下游引物序列為5′-TGCGCCAAAGTGCTTACAGTGCA-3′；U6的上游引物序列為5′- CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列為5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；p16(擴增長度為241 bp，Tm=56 ℃)的上游引物序列為5′-CGTACCCCGATACAGGTGATG-3′，下游引物序列為5′-CGTCGTGATGTCCCCGCTCT-3′；p21(擴增長度為188 bp，Tm=56 ℃)：上游引物序列為5′-CTGGTGATGTCCGACCTGTTCC-3′，下游引物序列為5′-ACGCTCCCAGACGTAGTTGCC-3′；GAPDH (擴增長度為253 bp，Tm=56 ℃)上游引物序列為5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′，下游引物序列為5′- TTTGAGGGTGCAGCG-AACTT-3′。

2.5免疫組化(免疫熒光)檢測相關基因的表達 細胞爬片；4%的多聚甲醛固定15 min，空氣干燥5 min，PBS清洗標本3次，0.5% Triton X-100孵育20 min。PBS清洗標本1次，3% H2O2孵育15 min；PBS清洗標本1次；封閉血清孵育20 min，滴加I抗工作液，37 ℃孵育1～2 h或4 ℃過夜； PBS清洗標本3次，滴加適量生物素標記II抗工作液，37 ℃孵育10～30 min；PBS 沖洗，DAB顯色劑顯色3～5 min；蘇木精復染，脫水，透明，封片。免疫熒光與免疫組化步驟相同，換用帶熒光標記的II抗。免疫組化染色檢測p16蛋白表達，免疫熒光檢測p21蛋白表達情況。所有的免疫組化圖片采用Image-Pro Plus 6.0軟件測量平均吸光度值，進行半定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)按照均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，兩組均數(shù)間比較用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 VSMCs鑒定

大鼠VSMCs原代提取、培養(yǎng)，通過抗α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle antibody, α-SMA)免疫熒光染色鑒定，高倍鏡下可見大量細胞呈典型的“谷-峰狀”生長，細胞質內有大量紅色的、與細胞長軸平行的纖維絲，即α-肌動蛋白絲，核居中，呈卵圓形，表明血管平滑肌細胞培養(yǎng)成功。見圖1。

Figure 1.The immunofluorescence staining was used to identify the rat vascular smooth muscle cells.

2 血管平滑肌細胞miR-17表達水平的檢測

D-半乳糖誘導VSMCs衰老的第14天收集細胞，提取RNA，采用RT-qPCR檢測細胞內miR-17的表達水平變化，結果顯示，A-control組miR-17的表達顯著高于A-anti-miR-17組(P<0.01)，而較A-miR-17組顯著降低(P<0.01)，見圖2，說明miR-17-inhibitor和miR-17-mimics成功轉入細胞。

Figure 2.The expression of miR-17 in VSMCs on the fourteenth day after D-galactose induced senescence. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs A-control group; #P<0.05 vs N-control group.

3 miR-17對D-半乳糖誘導的VSMCs衰老的影響

3.1光鏡觀察VSMCs形態(tài) D-半乳糖誘導后的第3天，在100倍光鏡下觀察VSMCs形態(tài)。結果顯示，D-半乳糖誘導的衰老細胞與正常培養(yǎng)基組的細胞相比顯著增大，形態(tài)多樣化，見圖3。

Figure 3.The morphology of VSMCs on the third day after D-galactose induced senescence.

3.2β-半乳糖苷酶染色鑒定細胞衰老 D-半乳糖誘導后的第3天，采用β-半乳糖苷酶染色方法鑒定細胞衰老情況，結果顯示，與N-miR-17組相比，A-miR-17組β-半乳糖苷酶陽性細胞顯著增加(P<0.05);與N-anti-miR-17組相比,A-anti-miR-17組β-半乳糖苷酶陽性細胞顯著增加(P<0.01)；與N-control組相比，A-control組β-半乳糖苷酶陽性細胞顯著增加(P<0.01)。A-anti-miR-17 組β-半乳糖苷酶陽性細胞顯著高于A-miR-17組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The expression of β-galactosidase in VSMCs on the third day after D-galactose induced senescence. Mean±SD.n=3. *P<0.05 vs N-miR-17 group; ##P<0.01 vs N-anti-miR-17 group; △P<0.05 vs N-control group; ▲P<0.05 vs A-miR-17 group.

3.3免疫組化檢測p16蛋白表達 D-半乳糖誘導衰老后的第14天采用免疫熒光法檢測VSMCs中p16蛋白的表達變化。結果顯示，p16蛋白在A-miR-17組的表達較 N-miR-17組顯著增加(P<0.01)，在A-anti-miR-17組的表達較N-anti-miR-17組顯著增加(P<0.01)，而在A-control組的表達較A-anti-miR-17組顯著降低(P<0.01)，其余各組相互之間無顯著差異，見圖5。

Figure 5.The p16 protein expression in VSMCs on the fourteenth day after D-galactose induced senescence. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs N-miR-17 group; ##P<0.01 vs N-anti-miR-17 group; △△P<0.01 vs A-control group.

3.4免疫熒光法檢測p21蛋白表達 D-半乳糖誘導衰老后的第14天采用免疫熒光法檢測VSMCs中p21蛋白的表達。結果顯示，A-anti-miR-17組p21的表達較A-miR-17和A-control組顯著增加(P<0.01)；N-anti-miR-17組p21的表達較N-miR-17和N-control組顯著增加(P<0.01)。p21 在D-半乳糖誘導組中的表達較對應的正常培養(yǎng)組均顯著增加(P<0.01)，見圖6。

Figure 6.The p21 expression in VSMCs on the fourteenth day after D-galactose induced senescence. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs A-anti-miR-17 group;##P<0.01 vs N-anti-miR-17 group;△△P<0.01 vs N-miR-17 group;▲▲P<0.01 vs N-anti-miR-17 group; &&P<0.01 vs N-control group.

3.5RT-qPCR檢測p16和p21的mRNA表達 D-半乳糖誘導后的3、7和14天采用RT-qPCR檢測VSMCs細胞內p16和p21的mRNA表達。p16 mRNA的RT-qPCR結果顯示，在第3天和第7天，6組相互之間均沒有顯著差異(P>0.05)，在第14天，A-anti-miR-17組的p16 mRNA顯著高于A-miR-17組，其余各組間p16 mRNA表達亦無顯著差異,見圖7。

p21 mRNA的RT-qPCR結果顯示，導入anti-miR-17的細胞，無論是否加入D-半乳糖誘導，p21 mRNA表達隨培養(yǎng)時間延長顯著增加(P<0.01)。在D半乳糖誘導和正常衰老過程中，過表達miR-17使VSMCs 的p21表達顯著減少，抑制miR-17導致VSMCs 的p21表達顯著增加(P<0.01)，見圖7。

Figure 7.The p16 and p21 mRNA expression in VSMCs was detected using RT-qPCR on days 3,7 and 14 after D-galactose-induced senescence.Mean±SD.n=3.* P<0.05,**P<0.01 vs A-control group.

討 論

細胞衰老是指細胞生長永久阻滯在細胞周期的G1期，細胞在形態(tài)、生化及表觀遺傳上出現(xiàn)特征變化，是正常細胞必然的歸宿[11]。在人體內，細胞衰老與許多慢性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如高血壓、動脈粥樣硬化、糖尿病以及慢性腎臟病等[12-13]。

VSMCs衰老導致血管老化，衰老的VSMCs表型轉換促使血管壁中層肥厚、膠原沉積和血管鈣化等血管重構，導致血管疾病產(chǎn)生[14-15]。研究顯示[16]，動脈粥樣硬化斑塊平滑肌細胞衰老與端粒重復序列結合因子2(telomere repeat binding factor 2, TRF2)有關，衰老的VSMCs既促進動脈粥樣硬化，又促進斑塊易損性，預防VSMCs衰老可能是動脈粥樣硬化潛在的治療靶點。

本實驗通過觀察D-半乳糖誘導3 d后，衰老誘導組的VSMCs較N組細胞明顯增大，細胞形態(tài)呈現(xiàn)多樣化。D-半乳糖誘導的細胞β-半乳糖苷酶陽性細胞率較正常細胞均明顯增加，說明D-半乳糖誘導的VSMCs衰老模型建立成功。通過檢測VSMCs內miR-17 mRNA的表達水平顯示miR-17-mimics和miR-17-inhibitor成功轉入VSMCs細胞。D-半乳糖誘導3 d后，A-anti-miR-17 組β-半乳糖苷酶陽性細胞明顯高于A-miR-17組，說明miR-17能夠抑制大鼠VSMCs衰老。

根據(jù)引起衰老原因的不同，細胞衰老可被分為復制性衰老[15]和過早型衰老[17]2種，復制性衰老主要依賴于p53-p21Cip1/Waf1信號通路[18]，過早型衰老的發(fā)生與p53-p21Cip1/Waf1和p16INK4a/Rb信號通路的激活相關[19]。p16INK4a/Rb與p53-p21Cip1/Waf1信號通路是細胞衰老過程中至關重要的2條信號通路[20]，當這2條通路中的關鍵調控因子，如p21蛋白表達下降或細胞周期蛋白cyclin D的表達上調時，可以延緩細胞衰老或繞過衰老程序繼續(xù)增殖。

本實驗檢測p16蛋白和mRNA表達結果顯示，誘導衰老組和正常培養(yǎng)組早期表達沒有顯著增加，但14 d后有顯著增加。過表達和抑制miR-17未導致p16顯著變化，說明miR-17抑制VSMCs衰老不是通過p16實現(xiàn)的。本實驗同時檢測p21蛋白和mRNA的表達顯示，誘導衰老組和正常培養(yǎng)組VSMCs中p21表達隨培養(yǎng)時間延長均有顯著增加；過表達miR-17導致p21表達顯著減少，抑制miR-17表達使p21表達顯著增加，說明miR-17抑制VSMCs衰老與p21有關。

綜上所述，miR-17能夠抑制D-半乳糖誘導的大鼠VSMCs衰老，其機制與p21表達有關。有必要深入研究miR-17在VSMCs衰老調控中作用及其在動脈粥樣硬化防治中的潛在作用。