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    新吉細(xì)毛羊5 個(gè)生殖激素受體基因多態(tài)性分析

    2019-12-26 05:01:24吳翠玲趙云輝柴浩晨張明新王春昕
    中國(guó)畜牧雜志 2019年12期
    關(guān)鍵詞:細(xì)毛羊產(chǎn)羔外顯子

    吳翠玲,謝 平,趙 卓,趙云輝,翟 博,柴浩晨,3,張明新*,王春昕*

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130000;2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,吉林公主嶺 136100;3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,陜西楊凌 712100)

    家畜繁殖性狀的高低決定了畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益,其中產(chǎn)仔數(shù)是家畜繁殖性狀的重要數(shù)量性狀。但綿羊產(chǎn)羔數(shù)又是一個(gè)遺傳力低、難以改良的經(jīng)濟(jì)性狀。綿羊繁殖性能主要由下丘腦-垂體-性腺軸(HPGA)調(diào)節(jié)[1]。下丘腦產(chǎn)生的GnRH與其受體GnRHR結(jié)合后調(diào)節(jié)垂體前葉LH、FSH激素的合成和釋放。增加GnRH的分泌和GnRHR的數(shù)量會(huì)引起LH釋放高峰,而LH釋放高峰能促進(jìn)哺乳動(dòng)物排卵。其中LH與FSH化學(xué)本質(zhì)是糖蛋白,LH可促進(jìn)膽固醇在性腺細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為性激素。FSH能促進(jìn)母畜卵泡、顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)和雌激素合成。LH和FSH與受體結(jié)合后促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)成熟,誘導(dǎo)排卵,促進(jìn)黃體生成[2]。催乳素(PRL)在垂體嗜酸細(xì)胞中合成和分泌,可促進(jìn)母畜乳腺組織發(fā)育,調(diào)控雌激素分泌合成,抑制排卵。PRL 與其受體PRLR 結(jié)合后,通過JAK2/STAT5 信號(hào)系統(tǒng)傳導(dǎo)信息,保證目標(biāo)基因的正常表達(dá)。雌激素主要由卵巢的顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞分泌,其受體ESR廣泛存在雌性哺乳動(dòng)物組織中,雌激素與ESR 結(jié)合后與FSH、LH協(xié)同調(diào)控動(dòng)物發(fā)情。因此HPGA 中的生殖激素及其受體是影響綿羊產(chǎn)羔率的重要因素,可以作為影響綿羊產(chǎn)仔數(shù)的重要候選基因[3-4]。

    新吉細(xì)毛羊是新疆畜牧科學(xué)院、新疆農(nóng)墾科學(xué)院和吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)合培育的細(xì)毛羊品種,具有凈毛率高、羊毛綜合品質(zhì)優(yōu)異、適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn),但新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔率只有115%~120%。提高新吉細(xì)毛羊繁殖力是目前待解決的關(guān)鍵問題。本研究對(duì)新吉細(xì)毛羊GnRHR、LHR、FSH、PRLR、ESR5 個(gè)基因多態(tài)性進(jìn)行分析,旨在為新吉細(xì)毛羊育種工作中提高繁殖力提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 在吉林省查干花種畜場(chǎng)采集新吉細(xì)毛羊119 只母羊血樣各7~10 mL,-20℃保存。收集整理119 只新吉細(xì)毛羊頭三胎產(chǎn)羔數(shù)據(jù);血液基因組柱式小量提取試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司,PCR Mixture 購(gòu)自天根生物科技有限公司;主要儀器包括核酸蛋白檢測(cè)儀(Quawell,美國(guó))、電泳儀(北京六一)、PCR 儀(伯樂,美國(guó))等。

    1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法

    1.2.1 PCR 擴(kuò)增 用血液基因組柱式小量提取試劑盒提取DNA。根據(jù)NCBI 登錄號(hào)利用primer 5 軟件對(duì)5 個(gè)基因外顯子區(qū)設(shè)計(jì)引物,在上海生工生物工程股份有限公司合成引物,引物序列及相關(guān)信息見表1。PCR 反應(yīng)體系:PCR Mixture10 μL,上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL,DNA 模板1.0 μL,加蒸餾水至20 μL。PCR 反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min,95℃變性30 s,退火30 s,退火溫度延伸1 min,34 個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

    1.2.2 測(cè)序與統(tǒng)計(jì)分析 將每個(gè)基因PCR 產(chǎn)物分別混池送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,用DNASTAR 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果分析。對(duì)存在突變的基因片段PCR 產(chǎn)物分別測(cè)序。利用Excel 計(jì)算基因型頻率。利用GraphPad prism 6 軟件進(jìn)行基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DNA 和PCR 產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果 提取的基因組DNA經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)OD260/280 值為1.8~2.1。說明提取的DNA 純度與質(zhì)量滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求?;騊CR產(chǎn)物結(jié)果見圖1。由圖1 可知,得到產(chǎn)物與預(yù)期片段大小一致,無雜帶,符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。

    圖1 5 個(gè)基因PCR 產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

    2.2 測(cè)序結(jié)果分析 測(cè)序發(fā)現(xiàn)FSHR基因不存在SNP 突變位點(diǎn)。GnRHR、LHR、PRLR、ESR基因突變位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2,4 個(gè)基因分型的測(cè)序結(jié)果如圖2~5。GnRHR基因存在2 個(gè)SNP 為cDNA 區(qū)發(fā)生的A505G、G720C突變,氨基酸分別發(fā)生G720C、R240S 改變。LHR基因存 在5 個(gè)SNP 為cDNA 區(qū)發(fā)生的T1262G、A1991G、C2012T、A2032T、T2041A 的突變,氨基酸分別發(fā)生D421A、Y664C、S671L、T678S、L681M 改 變。PRLR基因存在2 個(gè)SNP 為cDNA 區(qū)發(fā)生的A1263G、C1544G突變,氨基酸分別發(fā)生K387E、S480R 改變。ESR基因存在4個(gè)SNP為cDNA區(qū)發(fā)生的A106T、C181T、G612A、C735T 突變,其中A106T 突變導(dǎo)致氨基酸發(fā)生I36F 改變。后3 個(gè)為同義突變,未導(dǎo)致氨基酸的改變。

    表1 引物信息表

    表2 4 個(gè)基因突變位點(diǎn)信息表

    圖2 GnRHR 基因測(cè)序結(jié)果

    圖3 LHR 基因測(cè)序結(jié)果

    圖4 PRLR 基因測(cè)序結(jié)果

    圖5 ESR 基因測(cè)序結(jié)果

    2.3 統(tǒng)計(jì)分析 新吉細(xì)毛羊GnRHR、LHR、PRLR、ESR4 個(gè)基因多態(tài)位點(diǎn)的基因型、基因型頻率計(jì)算結(jié)果以及不同基因型對(duì)新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)的影響見表3。由表3 可知,除了GnRHR基因A505G 突變,LHR基因C2012T、A2032T 的突變,PRLR基因A1263G 突變,ESR基因C735T 突變只有2 種基因型,其他突變位點(diǎn)有3 種基因型。在新吉細(xì)毛羊群體4 個(gè)基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果中,只有ESR基因A106T 突變對(duì)新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著。其中 AA、AT、TT 3 種基因型個(gè)體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.391、1.101、1.417。AA 基因型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)比AT 基因型分別多0.290、0.316 個(gè)(P<0.05)。AA 型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)之間差異不顯著(P>0.05)。

    3 討 論

    數(shù)量性狀的表型值是由基因型值和環(huán)境值共同作用的結(jié)果。遺傳效應(yīng)是產(chǎn)生表型變異的內(nèi)因,環(huán)境效應(yīng)是表型變異的外部原因。近年來,為提高綿羊產(chǎn)羔數(shù),給養(yǎng)羊業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐、選種選配提供理論依據(jù)。國(guó)內(nèi)外從遺傳效應(yīng)方面開展了大量多胎候選基因多態(tài)性的研究[5]。本實(shí)驗(yàn)研究了5 個(gè)關(guān)鍵的生殖激素受體基因:GnRHR、LHR、FSHR、PRLR、ESR。目前研究發(fā)現(xiàn)GnRHR基因?qū)S淮山羊、濟(jì)寧青山羊、古藺馬羊、川東山羊、西農(nóng)薩能奶山羊、貴州白山羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著[6-7];FSHR基因?qū)Σ柹窖?、貴州黑山羊、遼寧絨山羊、薩能奶山羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著[8];PRLR基因?qū)χ袊?guó)美利奴(新疆型)多胎品系、小尾寒羊、關(guān)中山羊、波爾山羊、濟(jì)寧青山羊[9-10]產(chǎn)羔數(shù)影響顯著;ESR基因?qū)π∥埠?、湖羊、?jì)寧青山羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著[11]。

    3.1GnRHR基因多態(tài)性分析GnRHR是G 蛋白耦聯(lián)受體家族成員,在垂體表面、淋巴細(xì)胞、乳腺、卵巢和前列腺中表達(dá)。GnRHR基因是分子標(biāo)記的研究熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外對(duì)GnRHR基因多態(tài)性進(jìn)行了大量的研究[7,12]。本研究對(duì)GnRHR基因的全部外顯子共設(shè)計(jì)了4 對(duì)引物,在外顯子2、外顯子3 分別發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變。其中G720C 突變位點(diǎn)只有一個(gè)樣本為CC 型,雖產(chǎn)羔數(shù)為2,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其結(jié)果可能存在偶然性,CC 型也有可能是新吉細(xì)毛樣雙羔性狀的標(biāo)記,需加大樣本量,進(jìn)一步驗(yàn)證。

    3.2LHR基因多態(tài)性分析 目前的研究中,對(duì)綿羊LHR基因多態(tài)性研究較少,大多集中在LHβ基因上。因?yàn)長(zhǎng)H基因的β亞基具有激素和物種特異性,識(shí)別、結(jié)合靶組織的特異受體,決定激素的生理特異性。但激素發(fā)揮作用必須依賴受體。LHR基因外顯子10、外顯子11 組成編碼區(qū),本實(shí)驗(yàn)中主要對(duì)LHR基因外顯子11 多態(tài)性研究,發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)SNP 錯(cuò)義突變位點(diǎn),均與新吉細(xì)毛羊產(chǎn)仔數(shù)無顯著相關(guān)。王利紅[13]利用PCRSSCP 技術(shù)對(duì)湖羊、晉中綿羊和陵川半細(xì)毛羊LHR基因外顯子11 的多態(tài)性進(jìn)行了研究,雖發(fā)現(xiàn)4 個(gè)突變位點(diǎn),其中3 個(gè)突變位點(diǎn)A1991G、A2032T、T2041A 與新吉細(xì)毛羊上發(fā)現(xiàn)的相同,但均未對(duì)綿羊產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)生顯著影響,其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似。推測(cè)LHR不是新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔性狀的主效基因。

    3.3FSHR基因多態(tài)性分析 國(guó)內(nèi)外大量研究表明FSHR基因多態(tài)性對(duì)動(dòng)物產(chǎn)羔數(shù)具有重要影響。本研究主要對(duì)FSHR基因外顯子9、外顯子10 多態(tài)性分析,共設(shè)計(jì)3 對(duì)引物,其中對(duì)FSHR基因外顯子10 設(shè)計(jì)2對(duì)引物,第一對(duì)引物PCR 產(chǎn)物全長(zhǎng)1 271 bp,覆蓋全部外顯子。由于PCR 產(chǎn)物過長(zhǎng),未在實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1 中表示。測(cè)序結(jié)果表明3 對(duì)引物的PCR 產(chǎn)物均未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。除了FSHR基因的外顯子9、外顯子10 以外,外顯子7 與5'端調(diào)控區(qū)也是該基因的研究熱點(diǎn)[14]。為最大挖掘新吉細(xì)毛羊多胎基因,應(yīng)對(duì)FSHR基因其他區(qū)域進(jìn)行深入研究。

    表3 新吉細(xì)毛羊4 個(gè)基因的基因型頻率、對(duì)產(chǎn)羔數(shù)影響

    3.4PRLR基因多態(tài)性分析PRLR是細(xì)胞因子受體家族成員。目前國(guó)內(nèi)外研究將PRLR基因作為豬繁殖性能的一個(gè)主效基因。豬的PRLR基因存在Alu I 酶切位點(diǎn),其等位基因A 公認(rèn)為豬產(chǎn)仔性狀的優(yōu)勢(shì)基因型[15]。除此之外,PRLR基因與FSHβ、ESR、RBP4基因互作對(duì)豬繁殖性能有顯著影響。本研究對(duì)新吉細(xì)毛羊的PRLR基因外顯子10 多態(tài)性進(jìn)行了分析,共設(shè)計(jì)兩對(duì)引物,在引物P1、P2 的PCR 產(chǎn)物中各發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變:A1263G、C1544G。在A1263G 突變中,不存在GG 基因型。張向楠利用PCR-SSCP 技術(shù)檢測(cè)4 個(gè)綿羊群體PRLR基因外顯子10,發(fā)現(xiàn)A1263G 突變存在GG 基因型,其基因型頻率極低。該結(jié)果與本研究結(jié)果相似,不同基因型對(duì)產(chǎn)羔數(shù)影響差異不顯著[16]。在C1544G 突變中,雖然不同基因型對(duì)新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。但產(chǎn)羔數(shù)趨勢(shì)為CC 型>CG 型>GG 型。吳洪賓利用PCR-SSCP 技術(shù)在中國(guó)美利奴羊中發(fā)現(xiàn)相同突變位點(diǎn),其GG 型3 月齡出生重比CC 型大約重1.7 kg。但產(chǎn)羔數(shù)趨勢(shì)與本研究結(jié)果一致,CC 型產(chǎn)羔數(shù)比GG 型約多0.3 只[17]。推測(cè)C 等位基因是綿羊多胎性狀優(yōu)勢(shì)基因。

    3.5ESR基因多態(tài)性分析ESR基因被公認(rèn)為豬繁殖性狀的主效基因。ESR基因的Pvu II 多態(tài)位點(diǎn)與豬的產(chǎn)仔數(shù)存在緊密聯(lián)系[18]。綿羊中對(duì)ESR基因研究主要集中在外顯子1 和外顯子4 上。因此本研究對(duì)ESR基因外顯子1 和外顯子4 多態(tài)性進(jìn)行分析,共設(shè)計(jì)2 對(duì)引物。在P1 的PCR 產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一個(gè)錯(cuò)義突變A106T。P2的PCR 產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)3 處同義突變:C181T、G612A、C735T。在A106T 的研究中發(fā)現(xiàn)AA 基因型與TT 基因型比AT 基因型產(chǎn)羔數(shù)約多0.3 只(P<0.05),推測(cè)AA 型和TT 型為優(yōu)勢(shì)基因型。

    綜上所述,在5 個(gè)生殖激素受體基因中發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)對(duì)新吉細(xì)毛羊的產(chǎn)羔數(shù)無顯著影響。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)新吉細(xì)毛羊BMPR-1B基因、BMP15基因、GDF9基因多態(tài)性對(duì)產(chǎn)羔數(shù)也無顯著影響[19-20]。同時(shí)單一基因的輔助育種效率低、世代間隔長(zhǎng),已經(jīng)不能滿足目前養(yǎng)羊業(yè)育種的需求。為提高新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔率,將進(jìn)一步在引進(jìn)多胎基因、基因聯(lián)合、幼雛超排[21]等方面提高產(chǎn)羔率。

    4 結(jié) 論

    本研究發(fā)現(xiàn)FSHR基因不存在突變位點(diǎn),其余4 個(gè)基因存在13 個(gè)突變位點(diǎn)。GnRHR基因存在A505G、G720C 突變,LHR基因存在T1262G、A1991G、C2012T、A2032T、T2041A 突變,PRLR基因存在A1263G、C1544G突變,ESR基因存在A106T、C181T、G612A、C735T突變。在新吉細(xì)毛羊群體4 個(gè)基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析結(jié)果中,只有ESR基因A106T 突變對(duì)新吉細(xì)毛羊產(chǎn)羔數(shù)影響顯著。其中AA、AT、TT 3 種基因型個(gè)體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.391、1.101、1.417。AA 基因型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)比AT 基因型分別多0.290、0.316個(gè)。AA 基因型、TT 基因型平均產(chǎn)羔數(shù)差異不顯著。

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