大黃黃連瀉心湯對(duì)2 型糖尿病大鼠骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 表達(dá)的影響

郝建華 包毅敏 包 蕓 鹿 偉 張超偉 郝藝杰

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010030；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010050

隨著人們生活水平和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后，排名第三位的威脅人類健康的慢性系統(tǒng)性疾?。?-2］。DM 中90%以上的患者屬于2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM），其發(fā)病率高，病程長(zhǎng)，易引發(fā)心腦血管、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等多種并發(fā)癥，使T2DM 的預(yù)防和治療成為研究的熱點(diǎn)；T2DM 的發(fā)病因素多，病理機(jī)制復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制與體內(nèi)多種代謝相關(guān)酶、血糖調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)系密切，腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-acticated protein kinase，AMPK）、PI3K/Akt、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、FoxO、NF-κB 等多種信號(hào)通路廣泛參與了血糖的調(diào)控［3-4］，使T2DM 的發(fā)病機(jī)制成為研究的難點(diǎn)。通過(guò)對(duì)T2DM 代謝相關(guān)信號(hào)通路的研究，明確作用靶點(diǎn)，開發(fā)調(diào)節(jié)血糖代謝相關(guān)信號(hào)通路的抑制劑或激活劑，對(duì)臨床治療具有重要意義。

中藥治療T2DM 具有多途徑、多通道、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，在臨床中被廣泛應(yīng)用。大黃黃連瀉心湯出自《傷寒雜病論》，臨床應(yīng)用能夠降糖、降脂、減輕體重，能夠改善患者多飲、多食等癥狀，對(duì)于T2DM 有較好的療效［5-8］。本實(shí)驗(yàn)采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素（STZ）法構(gòu)建T2DM 大鼠模型，觀察大黃黃連瀉心湯對(duì)糖脂代謝的影響，對(duì)骨骼肌中腺苷酸活化蛋白激酶α（AMPKα）、過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ共激活因子-1α（peroxisome proliferator activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose tRNAsporter 4，GLUT4）表達(dá)的影響，探討大黃黃連瀉心湯調(diào)節(jié)糖脂代謝與AMPK 信號(hào)通路的相關(guān)性，尋找其作用靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

SPF 級(jí)健康雄性Wister 大鼠40 只，體重（200±20）g，8 周齡，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蒙）2015-0001，SPF 級(jí)使用環(huán)境由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蒙）2015-0001，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心非屏障室，室溫20℃，濕度50%～70%，光暗周期（12 h/12 h），動(dòng)物自由攝食飲水；高糖高脂飼料（豬油10%、糖20%、膽固醇2.5%、膽酸鈉0.5%、基礎(chǔ)飼料67%）購(gòu)于北京科澳協(xié)力飼料有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及主要試劑

大黃黃連瀉心湯（根據(jù)《金匱要略》所載的配比劑量，大黃∶黃連∶黃芩為2∶1∶1）購(gòu)于內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)院；二甲雙胍（北京利齡制藥廠，生產(chǎn)批號(hào)：161014）；STZ（美國(guó)SIGMA 公司，貨號(hào)：SO-130，批號(hào)：18883-66-4）；大鼠葡萄糖試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，批號(hào)：YZB/滬2624-40-2014）；三酰甘油（TG）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A110-1）；總膽固醇（TC）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A111-1）；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：A113-1）；Phospho-AMPKα（Thr172）（40H9）Rabbit mAb（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：CST 2535S）；AMPKα Rabbit mAb（美國(guó)CST公司，批號(hào)：CST 2603S）；PCG-1α Mouse mAb（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：CST 2705S）；GLUT4 Mouse mAb（美國(guó)CST 公司，批號(hào)：CST 2823S）；AMPKα PGC-1α GLUT4 引物設(shè)計(jì)合成（生工生物工程股份有限責(zé)任公司，批號(hào)：111085660）；血糖儀（北京華益靜點(diǎn)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：878P19904000266）；PrimeScript RT 試劑盒（thermo 公司，批號(hào)：K1622）；BCA 試劑盒（Solarbio 公司，批號(hào)：PC0020）。

1.3 造模方法

40 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組10 只和造模組30 只?？瞻讓?duì)照組以普通飼料喂養(yǎng)，造模組以高糖高脂飼料喂養(yǎng)，4 周后禁食12 h，造模組腹腔內(nèi)注射STZ（25 mg/kg），空白對(duì)照組注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組按照原方案繼續(xù)喂養(yǎng)7 d 后，禁食12 h，取尾靜脈血，用血糖儀測(cè)定空腹血糖（FPG），以FPG≥7.8 mmo1/L 作為T2DM 模型成功與否的判斷標(biāo)準(zhǔn)［9-10］，造模組90%達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。3 只大鼠造模未成功，再次腹腔內(nèi)注射半劑量STZ（12.5 mg/kg），再以上述指標(biāo)評(píng)估，均造模成功。造模成功后所有大鼠以普通飼料喂養(yǎng)。

1.4 動(dòng)物分組與給藥方法

將造模成功的30 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為中藥組、二甲雙胍組、模型組，每組10 只。中藥組以大黃黃連瀉心湯灌胃，按照《動(dòng)物與人體的每公斤體重計(jì)量折算系數(shù)表》折算，給藥量為1 g/（100 g·d），二甲雙胍組按照18 mg/（100 g·d）以二甲雙胍灌胃，模型組、空白對(duì)照組予以等體積的生理鹽水灌胃，共4 周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有3 只大鼠死亡，空白對(duì)照組、中藥組及模型組各1 只，空白對(duì)照組及中藥組大鼠死亡前發(fā)現(xiàn)有鼻及口腔出血現(xiàn)象，死亡后經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)肺中有殘留液體，余臟器未見明顯異常，推測(cè)其死因可能是由灌胃手法不當(dāng)引起，模型組死亡大鼠經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)胃腸高度脹氣、腸梗阻，推測(cè)為急性酮癥酸中毒所致。

1.5 標(biāo)本取材與檢測(cè)

1.5.1 血糖、血脂測(cè)定 分別于藥物治療前、治療4 周后，禁食12 h，取各組大鼠尾靜脈血，用血糖儀測(cè)定FPG。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠禁食12 h，腹腔注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉、處死，腹主動(dòng)脈取血，離心機(jī)3000 r/min，離心10 min，離心半徑8 cm，分離出血清，送至內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究中心，-70℃冰箱保存。ELISA 法檢測(cè)FPG、TC、TG、LDL-C。

1.5.2 胰腺組織病理學(xué)觀察 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，切取胰腺組織，浸泡于10%的甲醛溶液中固定，后送至內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。胰腺組織沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡透明，浸蠟包埋，切片烘干，切片厚度4 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色。經(jīng)脫臘，水化，HE 染色，脫水，透明后封固，于光鏡下觀察胰腺組織細(xì)胞形態(tài)，顯微攝影。

1.5.3 RT-PCR 檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠取右后肢大腿骨骼肌，保于液氮中冷卻30 min，送至內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)研究中心，-80℃冰箱保存，進(jìn)行骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 檢測(cè)。所有大鼠各稱取60 mg 骨骼肌，研磨、冷卻后，加入Trizol溶液裂解，提取RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，光密度（OD）260 與OD280 比值在1.8～2.0 之間，以2 μg 的RNA 為基本模板量，應(yīng)用PrimeScript RT試劑盒，將RNA 逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參，加入AMPKα、PGC-1α、GLUT4 上下游引物，配置PCR擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件為：94℃×2 min，94℃×2 s，50℃×2 s，72℃×2 s，共40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本重復(fù)3 次，用2-ΔΔCt數(shù)值來(lái)分析AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表達(dá)量。見表1。

表1 AMPKα、PGC-1α、GLUT4 引物序列表

1.5.4 Western blot 檢測(cè) 測(cè)定骨骼肌中AMPKα、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（P-AMPKα）、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達(dá)量。所有大鼠各取稱取50 mg 骨骼肌，RIPA 細(xì)胞裂解液裂解提取蛋白，用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白含量后，每組各取50 μg，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酞（SDS-PAGE）凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（NC）膜，之后孵一抗Phospho-AMPKα 抗體（1 ∶1000）、AMPKα 抗體（1 ∶1000）、PCG-1α 抗體（1∶1000）、GLUT4 抗體（1∶1000）及內(nèi)參GAPDH 抗體（1∶800），4℃反應(yīng)過(guò)夜，TBS-T 漂洗后，相應(yīng)二抗工作液（1∶800）37℃孵育，TBS-T 漂洗，使用ECL 發(fā)光顯色液曝光，壓片，顯影并定影，掃描儀掃描圖片，用Image J軟件分析每個(gè)條帶的熒光強(qiáng)度值，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組治療前后尾靜脈FPG 比較

造模后，造模組FPG 顯著高于空白對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；中藥組、二甲雙胍組治療后FPG 較治療前顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。見表2。

表2 各組治療前后尾靜脈FPG 的比較（mmol/L，）

表2 各組治療前后尾靜脈FPG 的比較（mmol/L，）

注：與空白對(duì)照組治療前比較，#P ＜0.01。FPG：空腹血糖

2.2 各組治療后FPG、TC、TG、LDL-C 比較

與空白對(duì)照組比較，模型組TC、TG、LDL-C 均顯著升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05）。與模型組比較，治療后中藥組及二甲雙胍組FPG、TC、TG、LDL-C 均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。中藥組與二甲雙胍組FPG、TC、TG、LDL-C 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 各組治療后FPG、TC、TG、LDL-C 比較（mmol/L，）

表3 各組治療后FPG、TC、TG、LDL-C 比較（mmol/L，）

注：與空白對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。FPG：空腹血糖；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇

2.3 胰腺組織病理學(xué)觀察

空白對(duì)照組：胰島β 細(xì)胞數(shù)量多，呈團(tuán)索狀分布，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞邊界清楚，胞漿豐富，細(xì)胞核清晰可見；模型組：胰島β 細(xì)胞數(shù)量減少，外形較小，胞漿少，細(xì)胞核致密、溶解，出現(xiàn)透明樣變，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性。與模型組比較，中藥組和二甲雙胍組胰島結(jié)構(gòu)較完整，胰島β 細(xì)胞數(shù)量有所增加，空泡細(xì)胞減少，細(xì)胞變性程度較輕，細(xì)胞核清晰可見。見圖1。

圖1 各組大鼠胰腺HE 染色表現(xiàn)（400×）

2.4 各組AMPKα、PGC-1α、GLUT4的mRNA表達(dá)比較

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠骨骼肌中AMPKα、GLUT4 及PGC-1α 的mRAN 表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；與模型組比較，中藥組PGC-1α、GLUT4 及AMPKα 的mRAN 表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）；二甲雙胍組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRAN 表達(dá)量顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；中藥組與二甲雙胍組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRAN 表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見表4。

2.5 各組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4、GAPDH蛋白表達(dá)水平比較

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠骨骼肌中PAMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達(dá)量顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；與模型組比較，中藥組P-AMPKα、PGC-1α、GLUT4 及AMPKα 蛋白表達(dá)量顯著增高（P ＜0.05 或P ＜0.01）；二甲雙胍組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達(dá)量顯著增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。中藥組與二甲雙胍組，AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。中藥組、二甲雙胍組P-AMPKα/ AMPKα 顯著高于模型組（P ＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表5、圖2。

表4 各組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表達(dá)比較（）

表4 各組AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 表達(dá)比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α；PGC-1α：過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ 共激活因子-1α；GLUT4：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

表5 各組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達(dá)水平的比較（）

表5 各組P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4 蛋白表達(dá)水平的比較（）

注：與空白對(duì)照組比較，△△P ＜0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。P-AMPKα：磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α；AMPKα：腺苷酸活化蛋白激酶α；PGC-1α：過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ 共激活因子-1α；GLUT4：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4

圖2 各組AMPKα、P-AMPKα、PGC-1α、GLUT4、GAPDH 蛋白表達(dá)水平

3 討論

T2DM 的主要發(fā)病機(jī)制為胰島素抵抗和胰島素分泌障礙，在疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，高血糖和脂代謝紊亂又進(jìn)一步降低胰島素敏感性，并損傷胰島β 細(xì)胞功能，這是T2DM 發(fā)病機(jī)制中最重要的獲得性因素。研究發(fā)現(xiàn)，糖脂代謝紊亂與體內(nèi)多種代謝相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有密切關(guān)系，由于AMPK 信號(hào)通路對(duì)糖脂代謝起全方位的調(diào)控作用，能夠增加骨骼肌細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和代謝，增加脂肪酸氧化及減少三酰甘油合成，增加胰島素敏感性［11-12］，因此，AMPK 一直是DM研究中的重要靶點(diǎn)。

AMPK 作為能量調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，在細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP 比值升高、上游蛋白激酶等多因素的作用下被激活，使AMPK 具有活性，AMPK 被激活的標(biāo)志是α 亞基第172 位蘇氨酸（Thr172）的磷酸化，磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶（P-AMPK）通過(guò)磷酸化下游的一系列酶類底物，來(lái)調(diào)節(jié)糖脂代謝［13］。PGC-1α 是AMPK 下游的靶分子，AMPK 能夠促進(jìn)PGC-1α 磷酸化水平，增加它的表達(dá)量，來(lái)調(diào)控葡萄糖代謝、脂肪酸氧化及減少氧化應(yīng)激等［14］。骨胳肌是攝取和消耗葡萄糖的主要外周組織，葡萄糖進(jìn)入骨胳肌細(xì)胞需要細(xì)胞膜上的GLUT4 直接參與，激活的AMPK 使GLUT4 從囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，囊泡與細(xì)胞膜融合，才能使被插入細(xì)胞膜的GLUT4 用于轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，促進(jìn)葡萄糖的攝取量快速增加，降低血糖，因此，P-AMPK 能夠增加GLUT4 的轉(zhuǎn)位，進(jìn)而增強(qiáng)肌肉對(duì)胰島素的反應(yīng)［15］。同時(shí)，PGC-1α 又通過(guò)激活GLUT4 的上游調(diào)控子MEF2C，高效誘導(dǎo)GLUT4 的基因表達(dá)，使骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力進(jìn)一步提高［16］。二甲雙胍作為治療T2DM的一線用藥，是AMPK 信號(hào)通路的激活劑。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過(guò)抑制線粒體復(fù)合物I，降低ATP，升高AMP，來(lái)激活A(yù)MPK，抑制糖異生，降低血漿游離脂肪酸，增加胰島素分泌；通過(guò)增加肌肉中GLUT4 的轉(zhuǎn)位，促進(jìn)葡萄糖的攝??；通過(guò)上調(diào)線粒體中PGC-1α 的基因表達(dá)，增加胰島素敏感性，來(lái)降低血糖［17-20］。

DM 中醫(yī)學(xué)稱之為消渴，主要病機(jī)為氣陰兩虛、燥熱內(nèi)盛，由于熱傷氣陰，致使熱毒濁邪聚生，瘀阻血絡(luò)，火熱邪氣是DM 的基本致病因素和重要病理機(jī)制［21-23］，因此，本研究確立了清熱、化瘀、解毒的治法。大黃黃連瀉心湯中大黃能夠清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)，黃連、黃芩能夠清熱燥濕、瀉火解毒。本課題組在前期的臨床中應(yīng)用大黃黃連瀉心湯治療T2DM，發(fā)現(xiàn)患者口干多飲、多食、四肢麻木等癥狀減輕，血糖、血脂明顯降低，具有較好的臨床療效［24］。本研究采用高糖高脂飼料聯(lián)合小劑量STZ 法構(gòu)建T2DM 大鼠模型，造模后所有大鼠的FPG 均顯著高于空白對(duì)照組，說(shuō)明造模成功，證明此方法制備T2DM 大鼠模型可行。模型組大鼠胰島β 細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞透明樣變，F(xiàn)PG、TC、TG、LDL-C 明顯高于空白對(duì)照組，經(jīng)大黃黃連瀉心湯治療后，大鼠胰島β 細(xì)胞數(shù)量有所增加，細(xì)胞變性程度較輕，空泡細(xì)胞減少，檢測(cè)FPG、TC、TG、LDL-C 顯著降低，說(shuō)明大黃黃連瀉心湯能夠降低血糖、血脂，對(duì)胰島β 細(xì)胞具有修復(fù)和保護(hù)作用，與課題組前期的臨床觀察一致，證實(shí)了大黃黃連瀉心湯對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用。中藥組與二甲雙胍組比較，F(xiàn)PG、TC、TG、LDL-C 無(wú)顯著差異，說(shuō)明大黃黃連瀉心湯降糖、降脂療效確切，為臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，發(fā)生DM 時(shí)，骨骼肌中AMPKα、PGC-1α、GLUT4 的mRNA 及蛋白表達(dá)量減少，P-AMPKα/AMPKα 比值降低，說(shuō)明骨骼肌細(xì)胞中AMPK 磷酸化受到抑制，AMPKα 活性顯著降低，抑制了GLUT4、PGC-1α 表達(dá)，使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，出現(xiàn)胰島素調(diào)節(jié)障礙，血糖升高，這可能是外周組織出現(xiàn)胰島素抵抗的原因之一。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大黃黃連瀉心湯治療后，骨骼肌中P-AMPKα、AMPKα、PGC-1α、GLUT4的mRNA 及蛋白表達(dá)量增加，P-AMPKα/AMPKα 比值增高，與二甲雙胍組比較，結(jié)果一致，提示大黃黃連瀉心湯對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用與二甲雙胍一致，也與AMPK 信號(hào)通路相關(guān)，也是通過(guò)提高AMPK 磷酸化水平，激活A(yù)MPK，上調(diào)PGC-1α 和GLUT4 的表達(dá)，來(lái)降低血糖，這是其降糖、降脂作用機(jī)制的一個(gè)方面，AMPK 信號(hào)通路并不是大黃黃連瀉心湯調(diào)節(jié)血糖代謝的唯一通路，發(fā)現(xiàn)其可能作用的其他信號(hào)通路并明確作用靶點(diǎn)，還有待于進(jìn)一步研究。AMPKα 與GLUT4、PGC-1α 這兩個(gè)因子并不是完全獨(dú)立的，而是彼此聯(lián)系。AMPKα 可誘導(dǎo)PGC-1α、GLUT4 基因表達(dá)，PGC-1α 又可以調(diào)控GLUT4 的表達(dá)量，三者協(xié)同作用，使骨骼肌細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的能力提高。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用大黃黃連瀉心湯治療后，RT-PCR 和Western blot 的結(jié)果趨勢(shì)一致，AMPKα、GLUT4、PGC-1α 表達(dá)量均增加，說(shuō)明基因表達(dá)量的變化，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯，引起了蛋白表達(dá)量相應(yīng)的變化。

綜上所述，大黃黃連瀉心湯在T2DM 大鼠模型中應(yīng)用，降糖、降脂效果明顯，對(duì)胰島β 細(xì)胞具有修復(fù)和保護(hù)作用，其降糖機(jī)制與AMPK 信號(hào)通路相關(guān)，通過(guò)激活A(yù)MPKα，增加PGC-1α、GLUT4 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖脂代謝。本實(shí)驗(yàn)為大黃黃連瀉心湯的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)，它可能作為AMPK 信號(hào)通路的激活劑，為T2DM 的預(yù)防和治療提供新思路。