消化道真菌在克羅恩病中的研究進(jìn)展*

尹 娟 龐 智

南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院消化系疾病與營(yíng)養(yǎng)研究中心(215008)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease, CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病因?qū)W不明，目前普遍認(rèn)為環(huán)境、微生物等因素誘導(dǎo)遺傳易感個(gè)體的腸道對(duì)微生物產(chǎn)生異常免疫應(yīng)答導(dǎo)致的慢性炎癥與IBD發(fā)病有關(guān)。遺傳易感無(wú)菌動(dòng)物并不表現(xiàn)出結(jié)腸炎癥狀，表明微生物是IBD發(fā)生的必要條件[1]。隨著二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，近年涌現(xiàn)出大量研究應(yīng)用16S宏基因組測(cè)序分析CD患者消化道中復(fù)雜的微生物組成和菌群失調(diào)現(xiàn)象。同時(shí)，關(guān)于真核生物中的機(jī)會(huì)致病真菌與IBD發(fā)病和慢性化相關(guān)的報(bào)道也日益增多。與非CD患者相比，CD患者的抗真菌抗體水平更高，甚至在疾病確診前即已表現(xiàn)出差異[2-3]，支持這一群體存在真菌菌群失調(diào)的觀點(diǎn)。本文重點(diǎn)從病原學(xué)和宏基因組學(xué)角度綜述近期真菌在成人CD患者中的研究進(jìn)展。

一、腸道真菌與宿主免疫系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)

腸道真菌種類(lèi)受宿主遺傳背景、衛(wèi)生狀況、生活方式、抗菌藥物的使用等多種因素影響，最常出現(xiàn)于人體腸道的真菌為青霉屬、念珠菌屬和曲霉屬[4]。研究[5]表明食物來(lái)源對(duì)腸道真菌菌群組成有顯著影響，主食動(dòng)物性食物與主食植物性食物的人群腸道真菌菌群差異顯著。盡管在DNA水平檢測(cè)，真菌菌群在腸道微生物中的占比僅約0.1%～1%，但其平均體積為細(xì)菌的100倍以上，腸道真菌的生物總量及其對(duì)腸道微生態(tài)的作用可能被大大低估[6]。

定植于腸道的真菌與宿主免疫系統(tǒng)間的相互作用對(duì)維持宿主腸道健康極為重要。固有免疫受體如C型凝集素受體(dectin-1、dectin-2、mincle等)、Toll樣受體(TLR2、TLR4等)可識(shí)別真菌胞壁β-1,3-葡聚糖。Dectin-1可通過(guò)CARD9激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1、Th17細(xì)胞分化以及相關(guān)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生[7]；通過(guò)與腸道微生物間的作用調(diào)控調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)分化，從而調(diào)節(jié)腸道免疫穩(wěn)態(tài)[8]。關(guān)于真菌通過(guò)C型凝集素受體在IBD中作用的研究較為多見(jiàn)。Dectin-1缺失小鼠對(duì)葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎更為敏感；dectin-1基因多態(tài)性(CLEC7A)與UC病情重癥化顯著相關(guān)[9]。高表達(dá)dectin-1以及其他C型凝集素受體的CX3CR1+單核吞噬細(xì)胞可應(yīng)對(duì)多數(shù)共生真菌，通過(guò)Syk信號(hào)通路啟動(dòng)適應(yīng)性抗真菌免疫應(yīng)答，該細(xì)胞功能受損的小鼠更易被念珠菌屬誘導(dǎo)發(fā)生腸道疾??；CD患者存在CX3CR1編碼基因錯(cuò)義突變，并與抗真菌應(yīng)答受損相關(guān)[10]。因此，腸道真菌菌群穩(wěn)態(tài)與腸黏膜免疫平衡密切相關(guān)。

二、二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展對(duì)腸道真菌微生態(tài)研究的促進(jìn)作用

近20年來(lái)，不依賴于培養(yǎng)法的二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使研究消化道中難以培養(yǎng)的微生物成為可能。對(duì)真菌的分析系針對(duì)其高度保守的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1或ITS2)。不同測(cè)序平臺(tái)使用的策略各有其優(yōu)勢(shì)。Illumina測(cè)序平臺(tái)使用的循環(huán)可切除終止測(cè)序法策略同聚體錯(cuò)誤率低；454焦磷酸測(cè)序法可測(cè)序1 000 bp的長(zhǎng)片段，解除了測(cè)序的長(zhǎng)度限制；而SOLiD(sequencing by oligonucleotide ligation and detection，寡核苷酸連接和檢測(cè)測(cè)序)方法使大規(guī)模平行測(cè)序成為可能。Illumina測(cè)序的準(zhǔn)確性大于99.5%，其他連接酶法測(cè)序如SOLiD準(zhǔn)確性大于99.95%[11]。研究者可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的測(cè)序平臺(tái)。

運(yùn)算軟件的不斷發(fā)展，使計(jì)算出差異小于1%的OTU(operational taxonomic units，運(yùn)算分類(lèi)單位)成為可能，MED(minimum entropy decomposition)還可分辨近緣物種的真正差異和測(cè)序誤差[12]。生態(tài)學(xué)分類(lèi)概念被用于區(qū)分微生物種群，如alpha多樣性分析的shannon和simpson指數(shù)被用于計(jì)算樣本內(nèi)物種多樣性，而beta多樣性分析可評(píng)估樣本間多樣性。未來(lái)16S與ITS測(cè)序策略的整合，加之對(duì)復(fù)雜的細(xì)菌與真菌混合群體數(shù)據(jù)分析方法的發(fā)展，將促進(jìn)對(duì)真菌在健康和疾病中所起作用的評(píng)估工作[13]。

三、真菌在CD發(fā)病機(jī)制中的作用

應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)CD發(fā)病過(guò)程中的腸道菌群組成，可發(fā)現(xiàn)患者腸道細(xì)菌與真菌菌群組成多樣性相關(guān)，細(xì)菌與真菌菌群失調(diào)亦相關(guān)[13-14]。與健康對(duì)照者相比，CD患者結(jié)腸活檢標(biāo)本的真菌菌群生物多樣性更大[15]，炎癥黏膜真菌豐度和生物多樣性增加更為顯著[16]；糞便真菌菌群中白念珠菌、棒曲霉、新型隱球菌數(shù)量顯著增多，且糞便真菌生物多樣性與血清C反應(yīng)蛋白(CRP)和CD活動(dòng)指數(shù)呈顯著正相關(guān)[16]。Hoarau等[17]發(fā)現(xiàn)，CD患者與其無(wú)病一級(jí)親屬相比，熱帶念珠菌豐度顯著增高，并與CD生物學(xué)標(biāo)志物抗釀酒酵母抗體(ASCA)水平呈正相關(guān)，但真菌總體生物多樣性減少。Sokol等[18]分析了IBD患者的糞便樣本，發(fā)現(xiàn)其擔(dān)子菌門(mén)/子囊菌門(mén)比值較健康個(gè)體升高，釀酒酵母占比降低，白念珠菌占比增高。Liguori等[19]的研究顯示，CD患者黏膜相關(guān)菌群中銀耳亞綱Cystofilobasidiaceae科家族和光滑念珠菌過(guò)量，炎癥黏膜真菌總體數(shù)量增多，炭角菌目存在于炎癥黏膜，釀酒酵母和指甲絨黑粉類(lèi)酵母則存在于非炎癥黏膜。這些真菌只是路過(guò)菌還是與腸黏膜免疫相關(guān)，亟待深入研究。但上述研究均支持成人CD患者腸道真菌生物組成豐度大于健康人群的觀點(diǎn)。

人體內(nèi)真菌生態(tài)失調(diào)與內(nèi)穩(wěn)態(tài)是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，這一動(dòng)態(tài)變化很可能比真菌感染更常發(fā)生，從而對(duì)宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)影響[20-21]。近期研究表明共生真菌白念珠菌和釀酒酵母可馴化宿主免疫系統(tǒng)，該作用與真菌胞壁多糖幾丁質(zhì)有關(guān)。分離自白念珠菌的幾丁質(zhì)可通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(IL-10)抑制炎癥反應(yīng)[22]。以釀酒酵母幾丁質(zhì)預(yù)處理小鼠，可誘導(dǎo)小鼠對(duì)抗白念珠菌引起的致命感染；經(jīng)特定釀酒酵母菌株處理的人單核細(xì)胞，由脂多糖(LPS)刺激引起的促炎細(xì)胞因子IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)分泌增多，殺菌能力增強(qiáng)；分離自CD患者糞便樣本釀酒酵母的幾丁質(zhì)含量顯著高于環(huán)境中釀酒酵母的幾丁質(zhì)含量，可能在腸黏膜促炎細(xì)胞因子分泌中起調(diào)控作用[23]。

共生真菌在淋巴細(xì)胞再循環(huán)和誘導(dǎo)宿主免疫耐受中發(fā)揮重要作用。人類(lèi)出生后RALDH+樹(shù)突細(xì)胞(DCs)從固有層被招募至腸系膜和外周淋巴結(jié)的過(guò)程依賴于共生真菌。以抗真菌藥物處理SPF級(jí)小鼠，可導(dǎo)致其外周淋巴結(jié)中的RALDH+DCs顯著減少；而予小鼠外源性熱帶念珠菌可增加其外周淋巴結(jié)中的RALDH+DCs數(shù)量[24]。由此推測(cè)生命早期腸道微生物群對(duì)免疫系統(tǒng)的發(fā)育至關(guān)重要。有研究[25]報(bào)道，健康人群外周血中存在真菌特異性Treg細(xì)胞擴(kuò)增，其表型和功能特征均與胸腺來(lái)源的Treg細(xì)胞相同。小鼠小腸派伊爾結(jié)DCs識(shí)別白念珠菌誘導(dǎo)免疫耐受，此過(guò)程依賴于真菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的2,3吲哚胺雙加氧酶(2,3 indoleamine dioxy-genase， IDO)[26]。免疫耐受DCs產(chǎn)生的IDO促進(jìn)色氨酸代謝成為活化T細(xì)胞芳烴受體的底物，從而促進(jìn)Treg細(xì)胞產(chǎn)生[20，27]。根據(jù)上述結(jié)論推測(cè)，CD患者白念珠菌等共生真菌比例變化可調(diào)控外周血Treg細(xì)胞數(shù)量和免疫耐受。

目前對(duì)真菌在IBD發(fā)病中的作用機(jī)制并不明確，但研究[9]證實(shí)dectin-1基因與UC疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，dectin-1缺失小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎易感。CD患者抗真菌抗體水平升高，ASCA IgG和IgA被認(rèn)為是CD診斷和疾病進(jìn)程預(yù)測(cè)較好的生物學(xué)標(biāo)志物[2-3]?；谌蚪M關(guān)聯(lián)分析的研究[28]發(fā)現(xiàn)IBD與宿主抗真菌免疫相關(guān)。鑒于成人CD患者存在明顯的真菌菌群失調(diào)，共生真菌對(duì)腸黏膜免疫系統(tǒng)具有重要調(diào)節(jié)作用，生命早期免疫系統(tǒng)發(fā)育受真菌影響顯著，因此易感個(gè)體童年期真菌菌群組成對(duì)生命后期疾病風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估具有重要意義。亟待開(kāi)展更多基礎(chǔ)和轉(zhuǎn)化研究深入探索真菌菌群失調(diào)與CD發(fā)展間的因果關(guān)系。

四、CD患者腸道真菌菌群失調(diào)與現(xiàn)行治療方案的關(guān)系

現(xiàn)行CD早期有效治療方案為使用抗體靶向特定炎癥相關(guān)分子以減輕慢性炎癥，TNF-α、IL-12/23和白細(xì)胞黏附分子為常用治療靶點(diǎn)。靶向TNF-α的抗體主要有英夫利西單抗、阿達(dá)木單抗、賽妥珠單抗，優(yōu)特克單抗則是首個(gè)靶向IL-12/23 p40亞基的抗體。條件致病真菌如白念珠菌相關(guān)免疫反應(yīng)有TNF-α、IL-17、IL-23等參與[29-30]。因此上述CD治療方案與真菌感染(組織胞漿菌病、酵母菌病、球孢子菌病以及其他機(jī)會(huì)致病真菌感染)有關(guān)[31]。臨床試驗(yàn)中，與安慰劑相比，抗IL-17A單抗(蘇金單抗)治療組患者糞便炎癥介質(zhì)增多，發(fā)生黏膜皮膚念珠菌病的風(fēng)險(xiǎn)增加[32]。納入14篇文獻(xiàn)共1 524例IBD患者的系統(tǒng)綜述表明，IBD患者最常見(jiàn)的真菌感染為念珠菌屬感染(903例)，多數(shù)感染發(fā)生于抗TNF-α治療6個(gè)月內(nèi)[33]。

迄今尚無(wú)IBD抗真菌治療的臨床試驗(yàn)開(kāi)展。理論上，靶向IL-17、IL-23、IL-22、TNF-α細(xì)胞因子途徑可減輕促炎反應(yīng)和急性黏膜損傷，但也同時(shí)導(dǎo)致共生真菌減少，機(jī)會(huì)致病真菌豐度增加，這為IBD患者臨床檢測(cè)到病原真菌提供了合理的解釋。特別是Th17細(xì)胞因子，如IL-22可直接調(diào)節(jié)上皮抗微生物相關(guān)基因表達(dá)，包括腸上皮細(xì)胞Reg3γ以及Paneth細(xì)胞等的抗微生物產(chǎn)物。這些黏膜分泌物減少可促進(jìn)黏膜表面真菌生長(zhǎng)和定植。雖然上述現(xiàn)象并未被常規(guī)檢測(cè)到，但已有研究數(shù)據(jù)表明某些免疫靶向治療可致真菌負(fù)荷增加。由此可提出下述假設(shè)：IBD相關(guān)免疫反應(yīng)部分是由病原真菌所驅(qū)動(dòng)，特定治療方案可能緩解消化道對(duì)病原真菌的免疫反應(yīng)[13]。

五、益生真菌在IBD治療中的應(yīng)用

共生真菌對(duì)宿主免疫功能具有重要調(diào)節(jié)作用。目前在CD的臨床治療中，布拉酵母菌已被用于緩解腸道炎癥的輔助治療。近年來(lái)，其機(jī)制研究取得了一定進(jìn)展。作為一種益生真菌，布拉酵母菌可增強(qiáng)宿主腸道對(duì)病原菌的免疫反應(yīng)，限制CD、UC以及難辨梭菌結(jié)腸炎等病理性炎癥反應(yīng)[34]。布拉酵母菌培養(yǎng)上清液可直接抑制CD患者由LPS誘導(dǎo)的髓樣DCs及其促炎細(xì)胞因子分泌[35]。有研究[34]發(fā)現(xiàn)，布拉酵母菌可提高腸道總IgA水平。在小鼠結(jié)腸炎模型中，喂飼布拉酵母菌可減輕組織學(xué)炎癥反應(yīng)，抑制白念珠菌在腸道定植[36]。

另一見(jiàn)諸報(bào)道的益生真菌為乳酒假絲酵母。口服乳酒假絲酵母可緩解實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎，伴腸系膜淋巴結(jié)Treg細(xì)胞和調(diào)節(jié)性DCs增多以及固有層Th17細(xì)胞減少[37]。隨著高通量二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，未來(lái)研究或可關(guān)注腸黏膜或糞便樣本菌群分析中益生真菌的鑒定及其臨床應(yīng)用。

六、糞菌移植(FMT)與IBD

FMT最早系用于治療復(fù)發(fā)性難辨梭菌感染，可重建腸道菌群內(nèi)穩(wěn)態(tài)[38]。目前關(guān)于FMT在IBD治療中的應(yīng)用已成為研究熱點(diǎn)，但結(jié)論不一。一項(xiàng)關(guān)于FMT治療IBD的系統(tǒng)綜述顯示，17.4%～60.4%的IBD患者經(jīng)FMT治療后獲得臨床緩解，UC患者和CD患者的臨床緩解率分別為22%和60.5%[39]。目前關(guān)于FMT用于UC患者的研究更多。最近一項(xiàng)多中心、雙盲、隨機(jī)、安慰劑對(duì)照試驗(yàn)表明，多供體FMT可誘導(dǎo)活動(dòng)性UC臨床緩解和內(nèi)鏡改善，F(xiàn)MT后微生物多樣性增加并持續(xù)[40]。當(dāng)前關(guān)于FMT供體與受體糞便微生態(tài)的研究聚焦于細(xì)菌組成，尚無(wú)研究關(guān)注真菌組成在FMT治療前后微生物多樣性變化中的貢獻(xiàn)。隨著真菌菌群分析方法的改進(jìn)，真菌分析將在分析FMT供體與受體腸道微生態(tài)變化中占據(jù)重要地位。

七、小結(jié)與展望

IBD病因?qū)W研究強(qiáng)烈支持如下觀點(diǎn)：環(huán)境因素的改變可影響宿主腸道微生態(tài)，增加遺傳易感宿主的IBD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，繼而影響疾病進(jìn)展?，F(xiàn)有研究多聚焦于細(xì)菌菌群失調(diào)在IBD發(fā)病中的作用，但越來(lái)越多的研究數(shù)據(jù)表明真菌菌群組成在此過(guò)程中亦發(fā)生顯著變化，消化道中存在著更為復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境成分的相互作用。綜上所述，人類(lèi)消化道中真菌菌群多樣性的改變以及特定真菌種類(lèi)豐度的變化在IBD發(fā)病中起有一定作用，未來(lái)IBD相關(guān)研究應(yīng)更加關(guān)注真菌在IBD病因中的潛在作用。