貴州油茶葉枯病病原鑒定研究

秦紹釗 王建偉 張柱亭

摘 要 擬盤(pán)多毛孢菌屬真菌侵染的寄主種類多、范圍廣，可引起多種經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物的多類病害，病征具有多樣性。在前期對(duì)貴州省油茶葉枯病的研究過(guò)程中，分離到一個(gè)擬盤(pán)多毛孢菌的新致病菌KLXY-7-2。通過(guò)病原菌的分離與純化、形態(tài)學(xué)鑒定和微管蛋白基因（TUB2）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)等多種檢測(cè)方法，KLXY-7-2菌鑒定結(jié)果為木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。病原菌與擬盤(pán)多毛孢屬EF055226.1、EF055231.1真菌聚為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支，且置信度為99%。本研究所鑒定的油茶木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi），在油茶葉枯病的相關(guān)研究屬于首次報(bào)道，可為進(jìn)一步明確該病原菌的發(fā)生規(guī)律及預(yù)防時(shí)期提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 葉枯病;擬盤(pán)多毛孢;形態(tài)學(xué);新種;分子鑒定

中圖分類號(hào)：S794.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.26.067

油茶（Camellia oleifera）作為木本油料作物，在貴州省栽培歷史悠久，是發(fā)展農(nóng)業(yè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的重要支撐力量。擬盤(pán)多毛孢屬真菌是多種經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物病害的重要致病菌，感病后的典型病狀為葉枯，感病葉片壞死面積達(dá)整片葉1/2以上。國(guó)內(nèi)報(bào)道的擬盤(pán)多毛屬真菌侵染油茶的菌種主要有茶擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis theae）和小孢擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis microspora）[1-2]。

近年來(lái)，擬盤(pán)多毛孢菌的鑒定方法逐漸完善和規(guī)范，依據(jù)生物學(xué)、柯赫氏法則、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)等特征鑒定種類，結(jié)果較準(zhǔn)確和可信，逐漸解決了種類鑒定上易混淆的問(wèn)題。本研究所鑒定的油茶木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）在貴州油茶病害研究中未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

2016—2018年采集油茶葉枯病葉片標(biāo)本于凱里市、黎平縣、天柱縣、錦屏縣及黃平縣，分別集中于在6—8月，10—11月采集病樣，從病葉的病健交接處經(jīng)組織分離，用PDA培養(yǎng)3～5 d后，4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｈ~枯病病斑呈不規(guī)則狀，紅褐色至灰褐色，連片成大枯斑（如圖1）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離純化

常規(guī)組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無(wú)菌水漂洗干凈，PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

取5 mm菌餅在PDA平板26～28 ℃黑暗16 h培養(yǎng)，2～5 d連續(xù)觀察菌落的形態(tài)、顏色，并取10 μL孢子懸浮液在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄其大小及形態(tài)特征。

1.2.3 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

取50 mg菌絲經(jīng)液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259。引物如下：Bt2a 5-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3，Bt2b 5-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3。

將測(cè)序的rDNA-TUB2與GenBank中相關(guān)菌株序列利用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行比對(duì)分析。在基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中選出與各分離菌株相似度較高的相應(yīng)序列，將所選序列與GenBank中擬盤(pán)多毛孢菌的基因序列采用MEGA 7.0.14軟件中的最大簡(jiǎn)約法（MP）做聚類分析，所有堿基賦予相同權(quán)重，自展循環(huán)1 000次，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌菌落與形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)菌落近圓形，該菌株外觀呈白色，菌絲致密，整個(gè)菌株生長(zhǎng)較慢，中央隆起，氣生菌絲呈茸毛狀（如圖2-A）;培養(yǎng)皿反面菌落呈黃色，有褶皺，黃色菌上長(zhǎng)有白色菌絲，菌絲較短（如圖2-B）。22 ℃培養(yǎng)5天后，菌落和菌絲表面可見(jiàn)散布分生孢子盤(pán)。

分生孢子呈棍棒狀紡錘形，5個(gè)細(xì)胞，長(zhǎng)（20.5～

27.5）μm×（5.2～7.6）μm;中間2個(gè)有色細(xì)胞顏色較深，長(zhǎng)15.7～18.1 μm，兩端細(xì)胞色淺;孢子頂端有2～3根附屬絲，長(zhǎng)10.9～16.8 μm;基部附屬絲長(zhǎng)3.9～5.8 μm。

根據(jù)分離物的菌落和分生孢子形態(tài)特征，初步鑒定為木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）（如圖2）。

2.2 分子鑒定

本研究以3個(gè)分離菌DNA為模板，對(duì)其微管蛋白TUB2基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。經(jīng)NCBI Blastn確定3個(gè)菌株同屬于擬盤(pán)多毛孢屬木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi），與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致。

代表菌株KLXY-7-2的TUB2基因序列與擬盤(pán)多毛孢屬其他同屬菌株序列經(jīng)最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，與2株木防已擬盤(pán)多毛孢菌（EF055226.1，EF055231.1）親緣關(guān)系最近，以100%的支持率（Bootstrap=100%）聚為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支（如圖3）。因此，根據(jù)分離所得鑒定結(jié)果將KLXY-7-2菌株鑒定為木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)擴(kuò)增擬盤(pán)多毛孢菌的TUB2基因序列，將代表菌株KLXY-7-2序列與GenBank中已有序列做比對(duì)，聚類分析與序列分所得析結(jié)果顯示，擬盤(pán)多毛孢菌形成2個(gè)大的聚類群。該菌株形態(tài)特征與趙光材等[3]、吳文能等人[4]

描述的木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）基本一致。此外，通過(guò)病原菌的分離與純化、形態(tài)學(xué)鑒定和微管蛋白基因（TUB2）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)等多種檢測(cè)方法，對(duì)引起貴州油茶葉枯病的病原物進(jìn)行了系統(tǒng)性鑒定，分離菌株的基因序列與參考序列號(hào)的相似率為99%。因此，從形態(tài)學(xué)和分子方面證明該病原菌是木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）。在明確該致病菌種類后，后期將在室內(nèi)和田間開(kāi)展篩選低毒高效殺菌劑的研究工作，為油茶病害的綠色防控提供科學(xué)依據(jù)。本研究所鑒定的油茶木防已擬盤(pán)多毛孢菌（Pestalotiopsis cocculi）在貴州油茶病害研究中未見(jiàn)報(bào)道。

由于擬盤(pán)多毛孢屬真菌與寄主植物種類之間無(wú)特異?；裕参镏衅毡榇嬖?，種間形態(tài)特征差異不顯著，區(qū)分難度大，對(duì)病原菌鑒定與病害防治造成一定的困難，ITS1-TUB2序列相結(jié)合對(duì)擬盤(pán)多毛孢屬絕大多數(shù)種類起到較好的鑒別作用。因此，今后對(duì)病原菌采用形態(tài)特征結(jié)合多個(gè)基因位點(diǎn)的系統(tǒng)鑒定很有必要。

參考文獻(xiàn)：

[1] 盧東升，黃新華，代兵.信陽(yáng)市油茶病害及其病原鑒定[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，40（5）：83-85，111.

[2] 牛曉慶，陳良秋，付登強(qiáng)，等.油茶葉枯病菌的鑒定及生物學(xué)特性研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34（2）：352-357.

[3] 趙光材，李楠.擬盤(pán)多毛孢屬在云南的34個(gè)種[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995（4）：21-27.

[4] 吳文能，雷霽卿，李江闊，等.藍(lán)莓采后病害病原菌分離鑒定及抑菌藥劑篩選[J].北方園藝，2019（7）：58-64.

（責(zé)任編輯：趙中正）