羊肚菌液體培養(yǎng)基最適碳源氮源優(yōu)化研究

劉華晶 趙妍

摘 要 以羊肚菌東農(nóng)羊B為研究材料，通過基礎(chǔ)碳源、補充碳源、氮源對羊肚菌菌絲生長的影響，進而探討羊肚菌生長的最適液體發(fā)酵環(huán)境。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g·L-1、紅糖20 g·L-1、NH4NO3 3 g·L-1、KH2PO4 3 g·L-1、MgSO4 2 g·L-1、維生素B1 20 mg·L-1;最適培養(yǎng)條件為溫度26 ℃，每100 mL培養(yǎng)基接種7 mm×

7 mm菌塊，搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1，接種后靜置2 d，選用菌齡為7 d的菌種。培養(yǎng)7 d后菌絲干重達17.3 g·L-1。

關(guān)鍵詞 羊肚菌;液體培養(yǎng);菌絲體生物量

中圖分類號：S646.7 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.26.068

羊肚菌（Morchella spp.）屬于子囊菌亞門（Ascom-

ycotina）盤菌綱（Discomycetes）盤菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellacwae）羊肚菌屬（Morchella）[1]，是一類名貴的食藥用真菌。羊肚菌子實體中營養(yǎng)物質(zhì)的種類多、含量高，還含有硒和多糖類物質(zhì)，具有抗癌和增加人體免疫力的功效，作為一種食療價值較高的食用菌享譽海內(nèi)外。

目前，羊肚菌液體培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)方案還沒有一個統(tǒng)一的確定，不同的研究者有著不同的結(jié)果。韓融冰等[2]

以玉米粉1.0%、黃豆粉0.5%、MgSO4 0.05%、KH2PO4 0.1%、K2HPO4 0.1%，pH自然條件發(fā)酵羊肚菌菌絲提取多糖效果最好。熊亞等[3]以麩皮、葡萄糖、麥芽汁和玉米粉作為碳源加入，氮源選擇黃豆粉和酵母粉，溫度20～24 ℃，轉(zhuǎn)速為140～200 r·min-1。

碳源、氮源是菌絲生長過程中必需的營養(yǎng)物質(zhì)，本研究在考慮生產(chǎn)成本基礎(chǔ)上通過碳源、氮源的單因素篩選出最適配方，進而明確羊肚菌搖瓶培養(yǎng)的最優(yōu)條件，以利于生產(chǎn)中的推廣。

1 材料與方法

1.1 菌種

選用中國微生物菌種保藏中心菌株編號16791，菌株名東農(nóng)羊B的羊肚菌為試驗材料。

1.2 培養(yǎng)條件

基礎(chǔ)固體培養(yǎng)基為CPDA培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)的基本條件為：溫度26 ℃，培養(yǎng)皿培養(yǎng)7 d的菌株接種，每100 mL

培養(yǎng)基接種量為7 mm×7 mm，pH值為7，接種后靜置

48 h，搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1。

1.3 液體培養(yǎng)基碳源的確定

分別以馬鈴薯200 g、可溶性淀粉40 g、麥粒200 g、麥麩200 g加入1 000 mL培養(yǎng)基，篩選基礎(chǔ)碳源。分別以白糖、紅糖、麥芽糖、葡萄糖各20 g加入CPDA培養(yǎng)基，篩選補充碳源。培養(yǎng)基加入250 mL的錐形瓶內(nèi)，每瓶裝100 mL液體并滅菌。在基本培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d，收集菌絲球無菌水清洗2～3遍，每次3 min，50 ℃溫箱烘干至恒重。

1.4 液體培養(yǎng)基氮源的確定

分別以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硝酸銨、尿素各3 g作為CPDA培養(yǎng)基補充氮源，培養(yǎng)條件與1.2相同。

1.5 液體培養(yǎng)生長曲線測定

將本研究篩選出的最優(yōu)碳源、氮源添加到CPDA培養(yǎng)基中，接種后26 ℃溫箱靜置2 d，140 r·min-1搖床培養(yǎng)8 d，每隔24 h對菌絲生物量進行測定，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的影響

從圖1可看出，馬鈴薯作為碳源時，菌絲生長最佳，菌絲生物量是4.07 g·L-1;在麥粒作碳源時略差，為

3.12 g·L-1;可溶性淀粉以及麥麩作碳源時效果較差，分別為3.12 g·L-1和2.28 g·L-1。由圖2可知，羊肚菌能更好地利用紅糖，菌絲生物量達到9.84 g·L-1，其次為白糖和葡萄糖，分別是6.88 g·L-1和9.84 g·L-1，麥芽糖最差只有

4.92 g·L-1?？紤]到實際生產(chǎn)中的成本問題，選擇添加紅糖20 g、馬鈴薯200 g作為最佳碳源組合。

2.2 氮源的影響

由圖3可知，5種氮源對菌絲生長的影響差別不大，硝酸銨效果最好，菌絲生物量為5.71 g·L-1，酵母膏、蛋白胨、牛肉膏分別為5.50 g·L-1、5.23 g·L-1、4.77 g·L-1，尿素對于菌絲的效果最不理想，菌絲生物量只有2.98 g·L-1。

由此可知，羊肚菌液體培養(yǎng)的最優(yōu)氮源硝酸銨為3 g·L-1。

2.3 羊肚菌液體培養(yǎng)生長曲線

以馬鈴薯200 g·L-1、紅糖20 g·L-1、NH4NO3 3 g·L-1、KH2PO4 3 g·L-1、MgSO4 2 g·L-1、維生素B1 20 mg·L-1為最優(yōu)配方，繪制生長曲線，如圖4所示。圖4表明，0～2 d

時，菌種需適應(yīng)新的生長環(huán)境，從而生長緩慢，形成的菌絲球小而略微透明，培養(yǎng)基呈棕紅色，此時成為延滯期;隨著進入對數(shù)生長期（2～5 d），第3 d有明顯的菌絲球形成，菌絲逐漸適應(yīng)環(huán)境并快速繁殖，菌絲球變大，顏色成乳白色，培養(yǎng)基顏色逐漸變淺;接著是穩(wěn)定期（5～7 d），菌絲生長速度平緩，菌絲球數(shù)量處于平衡階段，在第7 d時菌絲生物量可達到頂峰，有17.3 g·L-1;最后進入衰亡期（7 d以后），第8 d起部分的菌絲球初步老化，菌絲表現(xiàn)出自溶現(xiàn)象，菌絲生物量開始緩慢減少，培養(yǎng)基顏色加深變渾濁。可見發(fā)酵生產(chǎn)菌絲的周期最佳天數(shù)為7 d。

3 結(jié)論與討論

紅糖是一種適合羊肚菌生長的碳源，除碳源外紅糖還含有維生素和微量元素以及葡萄糖、果糖等單糖，在提供營養(yǎng)的同時可以縮短發(fā)酵的延遲期。從氮源的篩選來看，氮源種類對于羊肚菌液體培養(yǎng)菌絲生成量的影響很大，硝酸銨的效果明顯強于蛋白胨和酵母膏。故選用硝酸銨作為液體培養(yǎng)的氮源。

綜合上述試驗可得出，羊肚菌的最佳液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200 g·L-1、紅糖20 g·L-1、NH4NO3 3 g·L-1、KH2PO4 3 g·L-1、MgSO4 2 g·L-1、維生素B1 20 mg·L-1，最佳培養(yǎng)條件為溫度26 ℃、菌齡7 d、接種后靜置2 d、搖床轉(zhuǎn)速140 r·min-1，培養(yǎng)7 d得到的菌絲最大生物量為17.3 g·L-1。

參考文獻：

[1] 范冬茹，范瑞紅，馬珂，等.木醋液對羊肚菌液體培養(yǎng)菌絲生長的影響[J].食用菌，2019，41（5）：21-22，26.

[2] 韓融冰，趙玉卉，路等學(xué)，等.羊肚菌多糖提取工藝研究[J].北方園藝，2018（23）：150-155.

[3] 熊亞，李敏杰.羊肚菌菌絲體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國釀造，2013，32（2）：114-118.

（責(zé)任編輯：趙中正）