布魯菌外膜蛋白Omp19突變體的構(gòu)建及免疫原性研究

郭鳳羽，殷瑛，宰曉東，李汭樺，王美榮，李耀輝，胡凱，李玉杰，徐俊杰，陳薇

軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所，北京100071

布魯菌（Brucella）是一種胞內(nèi)寄生的革蘭陰性細(xì)菌，是布魯菌病的病原體。布魯菌病是一種人畜共患的慢性傳染病[1]，世界衛(wèi)生組織（WHO）將該病歸為7 種被忽視的人畜共患病之一，是一種導(dǎo)致貧困持續(xù)存在的疾病[2]。人類主要通過食用被布魯菌污染的肉類及制品，或者接觸到被布魯菌感染的動(dòng)物組織等方式罹患布魯菌病[3]。人布魯菌病的癥狀主要包括波浪熱、盜汗和體虛等，此外還常伴有全身乏力、頭痛、關(guān)節(jié)痛、陽痿等，孕婦感染布魯菌后容易引發(fā)自然流產(chǎn)[4]。由布魯菌病所引起的這些慢性感染往往難以根治，給患者的生理及心理健康帶來較大危害。布魯菌主要分布于發(fā)展中國家，全世界有170 多個(gè)國家和地區(qū)存在人、畜布魯菌病的流行，布魯菌病患者約600 萬人，每年新發(fā)病例約50 萬人次[5-6]。布魯菌病在我國主要集中在北方農(nóng)牧業(yè)地區(qū)，現(xiàn)已擴(kuò)展至全國31 個(gè)省市地區(qū)[7]。目前對布魯菌病的防治主要依靠疫苗，減毒活疫苗104M 是目前我國惟一獲批的人用布魯菌病疫苗，其安全性和有效性得到一定驗(yàn)證，但仍存在接種方式復(fù)雜、免疫機(jī)制不明確、殘余毒力等問題[8]。因此，新型人用布魯菌疫苗的研制對于布魯菌病的預(yù)防和控制具有重要意義。

外膜蛋白19（outer membrane protein 19，Omp19）是存在于布魯菌表面的一種蛋白，在種型復(fù)雜的布魯菌中的同源性達(dá)90%以上[9]。Omp19蛋白全長有177 個(gè)氨基酸殘基，前端含有的信號肽使蛋白在胞內(nèi)合成后被跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，信號肽切割后蛋白被錨定于細(xì)菌外膜[10]。Omp19 對布魯菌黏附、侵襲、定殖及胞內(nèi)存活等多個(gè)生理功能起關(guān)鍵作用[11]。此外，Omp19 還被報(bào)道能夠誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，是對抗布魯菌感染的重要靶標(biāo)[12]，也被認(rèn)為有希望成為抗布魯菌病亞單位疫苗的重要候選組分[13]。Fiorentino 等通過敲除布魯菌疫苗株S19 的Omp19 基因發(fā)現(xiàn)Omp19 的缺失會(huì)使該疫苗失去保護(hù)能力[14]。另一項(xiàng)研究表明，給BALB/c小鼠口服重組表達(dá)的Omp19 蛋白，可以保護(hù)免疫小鼠對抗布魯菌的攻擊[15]。

本研究中，我們以前期構(gòu)建的含有Omp19 核酸序列的質(zhì)粒，對序列中編碼Cys 的堿基進(jìn)行缺失或替換突變，構(gòu)建一系列蛋白突變體，從中篩選到不形成2 條帶及多聚體的蛋白，比較突變體蛋白與Omp19 在理化性質(zhì)及免疫保護(hù)性上的異同，為以O(shè)mp19 為組分的布魯菌重組蛋白疫苗的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8 周雌性BALB/c 小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；大腸桿菌感受態(tài)DH5α、BL21（DE3）購自天根生化有限公司；布魯菌株104M、A19，質(zhì)粒pET-32a 為實(shí)驗(yàn)室保存；2×EasyTaqPCR supermix 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、NdeⅠ，T4DNA 連接酶及T4多聚核苷酸激酶購自NEB 公司；核酸凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化有限公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a購自Abcam 公司；SPXL 陽離子純化柱購自通用電氣公司；TMB 單組分顯色液及終止液、云克隆細(xì)胞因子檢測試劑盒購自北京蒂諾奧科技有限公司；引物由生工生物工程有限公司合成。

1.2 突變體質(zhì)粒的構(gòu)建

以前期構(gòu)建的含有Omp19 核酸序列的質(zhì)粒pET32a-Omp19 為模板，用引物M1u/M1d 擴(kuò)增編碼Omp19 第1 位Cys 缺失突變體M1 的DNA 序列（94℃ 5 min；94℃ 30 s、60℃ 1 min、72℃ 1 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min）。用NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)和T4DNA 連接酶將Omp19-M1 連接到pET32a 中，得到質(zhì)粒pET32a-Omp19-M1。以測序正確的pET32a-Omp19-M1 為模板，分別用突變引物M2u/M2d、M3u/M3d、M4u/M4d 擴(kuò)增Omp19-M1的86 位和106 位Cys 單點(diǎn)突變體和雙點(diǎn)突變體基因序列。以pET32a-Omp19 為模板，用突變引物M5u/M5d 擴(kuò)增Omp19 的86 位和106 位雙點(diǎn)突變體（94℃5 min；94℃30 s、60℃30 s、72℃6 min，25 個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min）。引物見表1，所有突變體結(jié)構(gòu)示意圖見圖1。用T4多聚核苷酸激酶和T4DNA 連接酶將質(zhì)粒進(jìn)行磷酸化和連接，得到質(zhì)粒pET32a-Omp19-M2～M5。

1.3 突變體蛋白的表達(dá)、鑒定和純化

將序列正確的突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE）感受態(tài)，挑取工程菌單克隆接種到5 mL LB 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 氨芐青霉素）中，37℃、220 r/min 過夜振蕩培養(yǎng)。次日以1∶100 的比例將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5 mL LB 液體培養(yǎng)基，37℃、220 r/min 振搖至菌液D600nm為0.6～0.8 時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 于28℃誘導(dǎo)表達(dá)5 h。離心收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

將過夜培養(yǎng)的重組菌以1∶100 的接種量接種至1 L LB 培養(yǎng)基（含100 μg/mL 氨芐青霉素），37℃振蕩培養(yǎng)至菌液D600nm為0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L 的IPTG 于28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h，8000 r/min 離心5 min 收集菌體，菌體沉淀用40 mL 緩沖液（20 mmol/L NaAc，pH4.0）重懸，冰上超聲20 min，4℃、12 000 r/min 離心10 min，上清用0.45μm 濾器過濾作為純化樣品。用SPXL 陽離子柱，以梯度洗脫（洗脫液為20 mmol/L NaAc，1 mol/L NaCl，pH4.0）的方式純化目的蛋白。用15%的SDS-PAGE 鑒定蛋白，Lowrry 法檢測蛋白濃度。

圖1 突變體結(jié)構(gòu)示意圖

表1 Omp19 突變體構(gòu)建引物

1.4 突變體蛋白的理化性質(zhì)分析

將純化得到的Omp19、M1、M4 委托北京百泰派克生物科技有限公司用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜開展相對分子質(zhì)量、N 端序列、二硫鍵的檢測。委托中國科學(xué)院過程工程研究所采用圓二色（circular dichroism，CD）光譜開展蛋白二級結(jié)構(gòu)的檢測分析。

1.5 突變體蛋白的免疫評價(jià)

40 只6～8 周齡的BALB/c 雌性小鼠隨機(jī)分成5組，分別經(jīng)皮下注射免疫Omp19、M1、M4 蛋白及104M 菌株，免疫佐劑為Al（OH）3。免疫104M 組為陽性對照組，PBS 組為陰性對照組（表2），除104M 免疫組只于0 d 免疫外，其余各組于0、14、28 d 免疫。

1.5.1 血清抗體滴度檢測 免疫35 d 時(shí)采血，分離血清，ELISA 法檢測抗Omp19 特異性抗體。Omp19 用包被緩沖液稀釋至2 μg/mL，按100 μL/孔加入96 孔酶標(biāo)板，4℃過夜包被；次日用PBST（PBS，2%吐溫，pH7.2）洗板4 次，加入封閉液（PBS，2% BSA），37℃封閉1 h；洗板，待測小鼠血清梯度稀釋，37℃孵育1 h；洗板，按1∶10 000 的比例加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠抗體IgG（檢測總抗體水平）或IgG1、IgG2a（檢測抗體亞類水平），37℃孵育45 min；洗板，加入TMB 單組分顯色液避光顯色6 min，加入終止液終止顯色。用Bio-Rad 酶標(biāo)儀檢測D450nm和D630nm值，以D=D450nm-D630nm作為最終吸光度值，大于2.1 倍D（陰性）的最大稀釋度為該樣品的抗體滴度。

二是加強(qiáng)“職業(yè)化”建設(shè)，在技能培訓(xùn)上強(qiáng)力度。近年來，馬鞍山市人社局充分發(fā)揮下崗再就業(yè)培訓(xùn)基地的職能，聯(lián)合馬鞍山市婦聯(lián)開辦家政服務(wù)員職業(yè)資格認(rèn)證培訓(xùn)和專題講座，共開辦培訓(xùn)班16期，培訓(xùn)人員3871人次，2465人獲初、中級職業(yè)資格證書。馬鞍山市工人文化宮職教中心圍繞“家政服務(wù)工程”舉辦培訓(xùn)班6期，300多名農(nóng)民工、失業(yè)人員參加培訓(xùn)。

1.5.2 細(xì)胞因子檢測 免疫后42 d，斷頸法隨機(jī)處死3 只小鼠，將無菌取出的脾臟置于篩網(wǎng)上，于RPMI1640 培養(yǎng)基中研磨；將研磨液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，室溫500 r/min 離心5 min，棄上清；向沉淀中加入3 mL 紅細(xì)胞裂解液（ACK），室溫裂解5 min，再加入RPMI1640 培養(yǎng)基至終體積為10 mL，室溫500 r/min 離心5 min，棄上清；加入2 mL RPMI1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，得到脾臟單細(xì)胞懸液（1×106/mL）。在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的各孔中加入100 μL 各組細(xì)胞懸液，再加入Omp19（5 μg/孔）用于刺激培養(yǎng)細(xì)胞，分別設(shè)置ConA（0.5 μg/孔）和RPMI1640 培養(yǎng)基作為陽性對照和陰性對照，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h 后離心收集細(xì)胞上清，用細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6、IL-17A 的分泌水平。

表2 蛋白免疫評價(jià)方式

1.6 攻毒評價(jià)

免疫后第35 d，各組隨機(jī)選取5 只小鼠，腹腔注射布魯菌株A19（1×106CFU/只）進(jìn)行攻毒評價(jià)，104M 疫苗株免疫組（1×105CFU/只）作為陽性對照，PBS 免疫組作為陰性對照。14 d 后將小鼠處死，無菌條件下摘取小鼠脾臟，將臟器在PBS 溶液中研磨制成勻漿，取組織勻漿100 μL 做適度濃度梯度稀釋后涂布無抗性的TSA 平板，37℃孵箱培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行臟器菌載量計(jì)數(shù)。結(jié)果以菌載量對數(shù)的平均值的形式（mean LgCFU）表示，同時(shí)將免疫組小鼠脾臟中布魯菌菌載量相對于對照組小鼠菌載量下降的數(shù)值定義為保護(hù)指數(shù)，即對照組與實(shí)驗(yàn)組的平均LgCFU 的差值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

顯著性分析采用單因素方差分析或t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及制圖均由GraphPad Prism 7.0 完成。

2 結(jié)果

2.1 突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

以pET32a-Omp19 質(zhì)粒為模板擴(kuò)增M1 的基因片段，通過2 條攜帶缺失突變的引物，分別將編碼Omp19 第1 位Cys 的堿基缺失，得到長度為468 bp 的M1 的序列片段，與理論值相符（圖2A）。同理，分別以pET32a-Omp19 和pET32a-M1質(zhì)粒為模板，利用反向PCR 分別擴(kuò)增得到大小約6000 bp，含有86、106 位單位點(diǎn)及雙位點(diǎn)突變的pET32a-M2～M5 質(zhì)粒的線性片段（圖2B）。經(jīng)測序鑒定，得到的核酸序列與預(yù)期一致。

2.2 突變體蛋白的表達(dá)與純化

對序列正確的突變體質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，陽離子柱SPXL 純化蛋白，用SDS-PAGE 對Omp19、突變體蛋白M1～M5 進(jìn)行還原及非還原電泳（圖3）。突變體M1 相對理論分子質(zhì)量為15 810，M2和M3 為15 780，M4 為15 820，M5 為15 870，電泳結(jié)果顯示條帶大小約為23 000，與預(yù)期稍有差異。此外，電泳結(jié)果顯示，Omp19 在非還原電泳條件下存在多聚體和多余條帶，第2 位Cys 的缺失（M1）消除了多余條帶的影響，第86 和106 位Cys 的替換（M4）不僅去除了多余條帶還能去除多聚體。

圖2 突變體片段擴(kuò)增及質(zhì)粒構(gòu)建

2.3 突變體蛋白理化性質(zhì)分析

為了研究Cys 的缺失或替換對Omp19 原有理化性質(zhì)和免疫原性的影響，利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分別比較了Omp19、M1 及M4 在相對分子質(zhì)量、N 端序列組成及二硫鍵組成上的異同。利用圓二色光譜分別比較了3 種蛋白二級結(jié)構(gòu)的異同。

2.3.1 相對分子質(zhì)量測定 采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測Omp19、M1、M4 蛋白的相對分子質(zhì)量（圖4）。測得Omp19 的相對分子質(zhì)量為31 550（理論值15 909），約為理論值的2 倍；M1的相對分子質(zhì)量為15 804（理論值15 805），M4的相對分子質(zhì)量為15 757（理論值15 757），均與其理論值相差不大。

2.3.2 N 端序列測定 蛋白質(zhì)的N 端與蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性息息相關(guān)。本研究檢測了M1 及M4蛋白的N 端6 個(gè)氨基酸殘基，M1 N 端序列為NH2-Met-Gln-Ser-Ser-Arg-Leu，M4 N 端序列為NH2-Met-Gln-Ser-Ser-Arg-Leu，與預(yù)期序列一致。

圖3 突變體蛋白表達(dá)及純化

圖4 質(zhì)譜分析測定Omp19、M1 及M4 的相對分子質(zhì)量

2.3.3 二硫鍵分析 采用蛋白酶解及LC-MS/MS方法檢測Omp19、M1、M4 蛋白分子中二硫鍵的數(shù)量及位置，在Omp19 第1、86、106 位均檢測到二硫鍵存在；M1 第86 及106 位檢測到二硫鍵，M4 未檢測到二硫鍵的存在，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3.4 二級結(jié)構(gòu)分析 遠(yuǎn)紫外圓二色光譜可以提供蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)信息。Omp19、M1 及M4 的遠(yuǎn)紫外圓二色光譜如圖5，3 種蛋白的光譜圖幾乎完全重合。通過儀器自帶軟件，擬合了3 種蛋白中4 種二級結(jié)構(gòu)的含量，如表3 所示?？梢钥吹剑? 種蛋白的α螺旋、β折疊和自由卷曲3 種二級結(jié)構(gòu)的含量基本一致，只在β轉(zhuǎn)角有稍許差異，這個(gè)結(jié)果提示2 種突變體蛋白各二級結(jié)構(gòu)的含量與Omp19 稍有不同但差別不大。

2.4 突變體蛋白的免疫評價(jià)

2.4.1 抗體水平 小鼠免疫后第35 d 取血，ELISA檢測針對Omp19 的特異性總抗體水平及抗體亞類水平（圖6）。結(jié)果顯示Omp19、M1、M4 免疫組激發(fā)的針對Omp19 的特異性IgG 抗體滴度分別為3.53×104、2.19×104、2.76×104，3 組間無顯著性差異。此外，如圖6B 所示，Omp19、M1、M4 免疫組激發(fā)的抗體亞類IgG1/IgG2a 的比值分別為1.48、1.45、1.40，IgG1/IgG2a 比值均大于1，3 組間無顯著性差異。

圖5 Omp19、M1 及M4 的遠(yuǎn)紫外圓二色譜

表3 Omp19、M1 及M4 的二級結(jié)構(gòu)分析

2.4.2 細(xì)胞因子水平 小鼠初次免疫后42 d，用ELISA 檢測試劑盒測定Omp19 體外刺激后各組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量（圖7）。結(jié)果表明，Omp19 抗原刺激后，Omp19、M1 及M4 免疫組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到的IFN-γ、IL-2、IL-6 分泌水平?jīng)]有顯著性差異，但M4 免疫組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測到的TNF-α和IL-17A 水平顯著低于Omp19 和M1 組。

2.5 免疫保護(hù)效果

為了評價(jià)3 種蛋白的保護(hù)效果，小鼠初次免疫后第35 d，用布魯菌A19（1×106CFU/只）對免疫小鼠進(jìn)行腹腔攻擊，利用保護(hù)指數(shù)評價(jià)Omp19、M1 及M4 的保護(hù)效力。結(jié)果顯示，Omp19及突變體免疫組小鼠攻毒后小鼠脾臟中的菌載量相對于PBS 組均顯著降低（P＜0.05），3 組之間沒有顯著差異，保護(hù)指數(shù)分別為1.42、1.39、1.38，均高于PBS 組。同時(shí)也觀察到3 組的保護(hù)指數(shù)與104M 疫苗株存在一定差距，結(jié)果見表4。

圖6 Omp19 抗原特異的抗體水平

圖7 Omp19 特異的細(xì)胞因子水平

表4 小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)保護(hù)性效果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

我國的布魯菌病疫情自1993 年出現(xiàn)反彈，隨后發(fā)病率迅速增長[16]。最新的全國法定傳染病疫情概況數(shù)據(jù)顯示，2018 年我國上報(bào)布魯菌病新發(fā)病例達(dá)到3.8 萬人次，發(fā)病率為2.73/10 萬，仍然處于較高位置[17]。疫苗是預(yù)防和控制布魯菌病的主要手段。目前，獸用布魯菌病疫苗已獲得廣泛使用，在控制布魯菌病疫情方面發(fā)揮著重要作用。人用布魯菌病疫苗研制較為困難，目前國外尚無疫苗上市，我國惟一獲批的人用布魯菌病疫苗為104M 株。104M 是一種皮上劃痕接種的減毒活疫苗，存在免疫機(jī)制不明確、有殘余毒力等問題[8]。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以重組蛋白疫苗與核酸疫苗為主的新型疫苗近年來成為布魯菌病疫苗研究的熱點(diǎn)[18]，國內(nèi)外也對包括Omp19 在內(nèi)的多個(gè)布魯菌抗原進(jìn)行了初步研究，其中Omp19 被認(rèn)為對布魯菌具有一定的保護(hù)作用[9]，但是相關(guān)的研究都不系統(tǒng)。

實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)在制備Omp19 蛋白時(shí)，目的蛋白附近存在另一條與之大小類似，且能與多抗結(jié)合的條帶，同時(shí)該蛋白還易形成多聚體。經(jīng)過對Omp19 蛋白氨基酸序列的分析，發(fā)現(xiàn)Omp19 蛋白序列分別在第1、86、106 位含有Cys，推測這可能是造成上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。為了探究Cys 在序列中的作用，我們構(gòu)建了一系列蛋白突變體并比較了相應(yīng)的理化性質(zhì)和免疫原性。SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示Omp19 及突變體蛋白的相對分子質(zhì)量為25 000，與理論值稍有差異；得到的突變體蛋白M1 去除了目的蛋白附近多余條帶并減少了多聚體或二聚體的形成，而突變體M4 不僅可以去除多余條帶，還能同時(shí)去除多聚體或二聚體。質(zhì)譜檢測結(jié)果顯示Omp19 的相對分子質(zhì)量為31 550，約為理論值的2 倍；突變體M1、M4 的相對分子質(zhì)量分別為15 804、15 757，與理論值基本相符。提示重組表達(dá)的Omp19 蛋白主要以二聚體形式存在，缺失第1 位Cys 或同時(shí)對86 位Cys 進(jìn)行Ala 替換，對106 位Cys 進(jìn)行Ser 替換可以減少或避免二聚體的形成。二硫鍵檢測結(jié)果表明，Omp19 蛋白中可以檢測到更多數(shù)量的二硫鍵位點(diǎn)，而M4 蛋白中檢測不到二硫鍵位點(diǎn)的存在，結(jié)合SDS-PAGE 和的相對分子質(zhì)量檢測結(jié)果，推測Omp19 蛋白中多聚體或二聚體的形成可能是由Cys 介導(dǎo)的二硫鍵引起。此外，圓二色譜結(jié)果顯示，Cys 的缺失或替換不會(huì)對Omp19 的二級結(jié)構(gòu)造成太大影響。免疫學(xué)檢測結(jié)果表明，相較于Omp19，M1 和M4 中Cys 的缺失或替換不會(huì)顯著影響Omp19 特異的總抗體水平和所激發(fā)的免疫反應(yīng)類型，主要以Th2 型反應(yīng)為主。Omp19 及突變體蛋白M1、M4 免疫組小鼠脾細(xì)胞經(jīng)抗原體外刺激后分泌的Omp19 特異的IFN-γ、IL-2、IL-6 水平?jīng)]有顯著性差異，但M4 免疫組小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌的TNF-α 和IL-17A 水平顯著低于Omp19 和M1 組。這個(gè)結(jié)果提示86 和106 位Cys的替換會(huì)影響Omp19 特異的部分細(xì)胞因子的產(chǎn)生。攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Omp19 及其突變體對布魯菌A19 株的攻擊均具有一定的保護(hù)效果，突變體蛋白激發(fā)的免疫保護(hù)效力與Omp19 沒有顯著性差異。

綜上所述，Cys 會(huì)影響Omp19 重組蛋白的制備和質(zhì)控，其缺失或替換對Omp19 原有的理化性質(zhì)和免疫原性影響不大。本工作為Omp19 作為布魯菌亞單位疫苗有效組分的研究提供了依據(jù)。