蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對肝癌HepG2 細(xì)胞生長抑制和凋亡的影響*

黃建峰，魏小棟，翟東升

（1.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院肝膽胰外科，恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院心胸外科，恩施 445000）

原發(fā)性肝癌屬于全世界范圍內(nèi)發(fā)病率非常高的惡性腫瘤之一[1]。中國流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肝癌的發(fā)病率僅次于肺癌、胃癌及食管癌，高居第4 位[2]。目前，肝癌治療手段包括肝移植、手術(shù)切除及局部消融等，對肝癌的預(yù)后有了一定的改善作用，但是肝癌整體預(yù)后并不明顯，因?yàn)檩^多患者確診時(shí)已是中晚期。因此，尋找治療原發(fā)性肝癌的新方法及新藥物已迫在眉睫。索拉菲尼是食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的晚期肝癌的標(biāo)準(zhǔn)治療藥物，但由于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，藥物的反應(yīng)率有所限制[3]。蘿卜硫素主要是從蔬菜中提取的天然活性成分，不僅能誘導(dǎo)正常細(xì)胞抵抗外來致癌物的能力，對腫瘤細(xì)胞也具有抑制作用[4]，其中包括肝癌細(xì)胞[5]。蘿卜硫素能抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡以及增加化療和靶向藥物的敏感性[6-8]。本文將探究蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對肝癌HepG2 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為肝癌的有效治療提供理論參考。

1 材料及方法

1.1 材料及試劑 肝癌HepG2 細(xì)胞由武漢大學(xué)人民醫(yī)院中心試驗(yàn)室饋贈；蘿卜硫素、索拉菲尼購買于Sigma 公司；二甲基亞砜（DMSO）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK8）購自Sigma-Aldrich 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒購自Hyclone 公司；胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco 公司；發(fā)光試劑ECL 購自Millipore 公司；兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白D1（ClinD1）、C-myc、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）、磷酸化核因子κB 抑制蛋白α（p-IκBα）及β-actin 抗體購自英國Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗購自上海谷歌公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 DMEM 培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素） 用于培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞，培養(yǎng)箱條件設(shè)置為恒溫37 ℃、5%CO2，細(xì)胞一旦生長融合至80%～90%時(shí)，進(jìn)行1∶2 傳代培養(yǎng)。蘿卜硫素、索拉菲尼采用DMSO 溶解，儲存濃度分別為100 μmol/L 和60 μmol/L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用完全培養(yǎng)液稀釋成不同濃度來干預(yù)細(xì)胞。

1.3 CCK8 檢測HepG2 細(xì)胞增殖 細(xì)胞分為對照組、蘿卜硫素組、索拉菲尼組及聯(lián)合給藥組，將HepG2 細(xì)胞（1×105/mL）均勻接種于96 孔板中，過夜待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行藥物干預(yù)。蘿卜硫素濃度為5、10、20、40、60、80 μmol/L，索拉菲尼濃度為2、4、6、10、20、40 μmol/L，聯(lián)合給藥取上述各單藥濃度組合。48 h 后吸干培養(yǎng)液，每孔加入20 μL CCK8 試劑，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，在酶標(biāo)儀450 nm 波長讀取吸光度A 值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[1-（藥物組A 值－對照組A 值）/（藥物組A 值－對照組A 值）]×100%。計(jì)算單藥的半數(shù)抑制濃度（IC50）值及協(xié)同作用（CI），CI＜1 表示兩種藥物有協(xié)同效應(yīng)，CI = 1 表示兩種藥物有相加效應(yīng)，CI＞1表示兩種藥物有拮抗效應(yīng)。取IC50值的藥物濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)劑量。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 細(xì)胞分組同“1.3”項(xiàng)，將HepG2 細(xì)胞（3×105/mL）均勻接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，進(jìn)行藥物干預(yù)，包括蘿卜硫素（36 μmol/L）、索拉菲尼（5 μmol/L）及其聯(lián)合給藥。48 h 后，收集細(xì)胞，按照Annexin V-FITC/PI 凋亡試劑盒操作說明書處理進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測蛋白表達(dá)按照“1.4”項(xiàng)處理后收集細(xì)胞，置于冰上加入RIPA裂解液充分裂解30 min，4 ℃、12 000 g/min 離心15 min，收集上清，采用二喹啉甲酸（BCA）法檢測總蛋白濃度，向上清中加入適量上樣緩沖液后100 ℃煮沸7 min，促使蛋白變性。冷切后，每孔上樣50 μg進(jìn)行蛋白電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，將NC 膜置于5%脫脂牛奶中封閉2 h；加入稀釋后抗體溶液，4 ℃搖床過夜。次日TBST 洗膜3 次，二抗常溫反應(yīng)1.5 h，再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。最后ECL 溶液顯色4 min 后利用BIO-RAD 成像系統(tǒng)對蛋白圖像進(jìn)行采集。蛋白灰度值采用Image J 軟件分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞增殖抑制率的影響 CCK8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示HepG2細(xì)胞增殖抑制率隨著蘿卜硫素、索拉菲尼濃度的增加而增高，蘿卜硫素、索拉菲尼單獨(dú)給藥48 h 的IC50分別為（36.8±4.67）μmol/L 和（5.37±0.94）μmol/L，見圖1。經(jīng)計(jì)算得各濃度單藥聯(lián)合時(shí)的CI 值，結(jié)果都低于1，說明蘿卜硫素和索拉菲尼具有協(xié)同作用。見圖2。

圖1 CCK8 法檢測蘿卜硫素和索拉菲尼對HepG2 細(xì)胞增殖的作用Fig.1 Effect of sulforaphane and sorafenib on the proliferation of HepG2 cells

圖2 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對HepG2 細(xì)胞的協(xié)同效應(yīng)Fig.2 Synergistic effects of sulforaphane combined with sorafenib on HepG2 cells

2.2 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測HepG2 細(xì)胞凋亡情況見圖3，其中對照組、蘿卜硫素組、索拉菲尼組及聯(lián)合給藥組細(xì)胞凋亡率分別為（0.64±0.03）%、（14.06±0.42）%、（16.68±0.07）%及（41.25±1.06）%，可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡（P＜0.05），并且聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2 細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）。

2.3 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞原癌基因表達(dá)的影響 Western Blot 方法分析HepG2 細(xì)胞中原癌基因ClinD1、C-myc 表達(dá)情況見圖4、表1，可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯抑制ClinD1、C-myc 蛋白表達(dá)（P＜0.05），并且聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2 細(xì)胞中ClinD1、C-myc 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖3 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對HepG2 細(xì)胞凋亡的作用Fig.3 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the apoptosis of HepG2 cells

圖4 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對原癌基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the expression of protocancer gene

表1 各組細(xì)胞間ClinD1、C-myc 蛋白表達(dá)水平的比較（x±s）Tab.1 Comparison of the expression levels of ClinD1 and C-myc proteins（x±s）

2.4 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western Blot 方法分析HepG2 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax 的表達(dá)情況見圖5、表2，可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)、誘導(dǎo)促凋亡蛋白表達(dá)（P＜0.05），并且聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2細(xì)胞Bcl-2 表達(dá)顯著降低，而Bax 表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖5 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the expression of apoptotic proteins

表2 各組細(xì)胞間Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平的比較（x±s）Tab.2 Comparison of the expression levels of Bcl-2 and Bax proteins（x±s）

2.5 蘿卜硫素、索拉菲尼及聯(lián)合給藥對HepG2 細(xì)胞NF-κB 信號通路磷酸化的影響 Western Blot 方法分析HepG2 細(xì)胞中NF-κB 信號通路蛋白磷酸化的情況，見圖6、表3，可見蘿卜硫素和索拉菲尼干預(yù)能明顯抑制NF-κB、IκBα 蛋白磷酸化（P＜0.05），而聯(lián)合給藥相對于單藥組HepG2 細(xì)胞中NF-κB、IκBα 蛋白磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼對NF-κB 信號通路的影響Fig.6 Effect of sulforaphane combined with sorafenib on the activation of NF-κB pathway

表3 各組細(xì)胞間p-NF-κB、p-IκBα 蛋白表達(dá)水平的比較（x±s）Tab.3 Comparison of the expression levels of p-NF-κB and p-IκBα proteins（x±s）

3 討論

早期研究已指出蘿卜硫素具有潛在的抗腫瘤活性，包括抗膀胱癌、肺癌、肝癌等[9-11]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素與化療或放療藥物聯(lián)合能對多種腫瘤細(xì)胞具有協(xié)同作用，而且還可能增強(qiáng)放療藥物介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡、部分逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的多藥耐藥性[12-14]。Liu 等[11]研究結(jié)果提示，蘿卜硫素可通過STAT3/HIF-1α/VEGF 信號通路表現(xiàn)出抗血管生成的藥理作用，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，提示蘿卜硫素對肝癌的預(yù)防和治療具有一定的作用。本文研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素、索拉菲尼對肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，而且還誘導(dǎo)其凋亡。然而，聯(lián)合給藥時(shí)細(xì)胞的生長抑制作用相對單藥組更為顯著，并通過計(jì)算聯(lián)合給藥指數(shù)CI發(fā)現(xiàn)均小于1，說明蘿卜硫素與索拉菲尼聯(lián)合給藥表現(xiàn)出協(xié)同作用。

近期已有研究證實(shí)NF-κB 信號通路活化能介導(dǎo)細(xì)胞周期、凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，包括原癌基因（ClinD1、C-myc）和凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax）等，進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[15]。NF-κB 信號通路激活與原發(fā)性肝癌密切相關(guān)[16]，并且藥物通過抑制該信號傳導(dǎo)，還能抑制肝癌細(xì)胞增殖、降低氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)[17]。蘿卜硫素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，并且發(fā)現(xiàn)其能通過抑制NF-κB 信號通路活化，進(jìn)而增強(qiáng)化療藥物對腫瘤細(xì)胞的敏感性[18]。本文研究發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼能明顯抑制NF-κB 和IκBα蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而下調(diào)了NF-κB 信號通路傳導(dǎo)。

CyclinD1 是細(xì)胞周期家族中與腫瘤發(fā)展最為密切的成員，作為一種重要的原癌基因，是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞由G1/S 期進(jìn)入G2 期的重要分子，過表達(dá)能導(dǎo)致細(xì)胞過度生長、轉(zhuǎn)化與癌變[19-21]。Bcl-2 和Bax的異常表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展、組織學(xué)類型及預(yù)后密切相關(guān)[22-24]；并且NF-κB 信號傳導(dǎo)能調(diào)節(jié)ClinD1、C-myc、Bcl-2 及Bax 基因的表達(dá)[25-28]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蘿卜硫素聯(lián)合索拉菲尼能明顯抑制ClinD1、C-myc及Bcl-2 蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)Bax 蛋白表達(dá)。早期研究表明蘿卜硫素可通過降低細(xì)胞周期相關(guān)蛋白ClinD1和C-myc 表達(dá)，并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 和Bax表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤的生物學(xué)作用[29]。綜上所述，蘿卜硫素與索拉菲尼聯(lián)合能共同抑制NF-κB 信號通路，發(fā)揮協(xié)同抗肝癌的作用。