芪丹利心丸對心肌梗死后慢性心力衰竭大鼠心肌纖維化的影響*

石斌豪，黃鈺婷，徐宗佩，樊官偉

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

慢性心力衰竭（CHF）是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈或射血能力受損的復(fù)雜臨床綜合征，以呼吸困難、乏力及液體潴留為主要表現(xiàn)。CHF的發(fā)病率不斷上升，急性心肌梗死是導(dǎo)致CHF 發(fā)病的主要疾病之一，而心肌纖維化是CHF 發(fā)病的主要原因之一，特別是心肌梗死導(dǎo)致的CHF 纖維化更加明顯[1-2]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）已被證實(shí)在心肌纖維化中扮演著重要角色，通過介導(dǎo)TGF-β1/Smads 信號通路將心肌成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積，導(dǎo)致心臟剛性增加、收縮舒張功能障礙[3]。

芪丹利心丸是天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科防治慢性心力衰竭的專利方（專利號：ZL 201110413471.1），是基于CHF 中醫(yī)病因病機(jī)特點(diǎn)，依據(jù)益氣活血利水的治則創(chuàng)制，對于CHF 本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜的證候特點(diǎn)具有針對性，在臨床應(yīng)用中有著良好療效[4]。利用益氣活血利水法治療CHF已有諸多報(bào)道[5-8]，在心力衰竭治療指南指導(dǎo)下聯(lián)合益氣活血利水方劑能提高心功能、緩解心力衰竭程度及心室重構(gòu)，但對益氣活血利水中藥的作用機(jī)制研究尚不充分，本研究通過芪丹利心丸干預(yù)CHF 大鼠的實(shí)驗(yàn)研究，以期闡釋其改善心功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 無特定病原體（SPF）健康Sprague-Dawley 雄性大鼠120 只，體質(zhì)量為220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.2 動物模型制備及分組 用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，頸部及胸前備皮，腹部朝上，固定四肢及頭部。經(jīng)口氣管插管連接小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，胸前手術(shù)于第3、4 肋間打開胸腔，暴露心臟。于顯微鏡下確定左冠狀動脈前降支位置（肺動脈圓錐與左心耳交界處），進(jìn)針深度約1.5 mm，結(jié)扎后心室前壁變蒼白，室壁運(yùn)動明顯減弱。用棉球吸除胸腔內(nèi)液體，擠出胸腔內(nèi)氣體，逐層縫合肌肉及皮膚，觀察有自主呼吸后拔除插管。另設(shè)假手術(shù)組（Sham，10 只），在冠狀動脈前降支下只穿線不進(jìn)行結(jié)扎。將冠狀動脈前降支結(jié)扎術(shù)后存活大鼠（86 只，術(shù)中死亡24 只）繼續(xù)飼養(yǎng)4 周后利用小動物超聲儀Vevo2100 測定左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），以LVEF 0.38～0.50 為CHF 制模成功，CHF 模型成功率約52%（45 只），剔除未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠后，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為模型組（Model，術(shù)后給予等體積生理鹽水）、芪丹利心丸（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，每克藥粉相當(dāng)于3.45 g 生藥）低[QD-L，1.1 g/（kg·d）]、中[QD-M，2.2 g/（kg·d）]、高[QD-H，4.4 g/（kg·d）] 劑量組和纈沙坦組[諾華制藥有限公司，Val，10 mg/（kg·d）]，各組均連續(xù)灌胃4 周。藥物干預(yù)后每組各剩余9 只。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 心動超聲及血流動力 給藥4 周后，各組隨機(jī)取6 只大鼠稱質(zhì)量，異氟烷麻醉，仰臥位固定，利用超聲心動儀Vevo2100 及左心室壓力-容積環(huán)檢測大鼠LVEF、左室短軸縮短率（LVFS）、左室收縮末期內(nèi)經(jīng)（LVESD）、左室內(nèi)壓上升或下降最大速率（±dp/dt max）等心臟功能指標(biāo)。

1.3.2 蛋白組學(xué)指標(biāo)檢測 將剩余大鼠（各組3 只）稱質(zhì)量，異氟烷麻醉，仰臥位固定，在腹主動脈取血后，經(jīng)腹主動脈用生理鹽水灌注沖洗，然后剪取大鼠心臟，除去心臟表面的血漬后用濾紙吸干水分稱質(zhì)量，再根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康碾S機(jī)每組各取3 只用于心臟病理觀察及相關(guān)蛋白組學(xué)指標(biāo)檢測：1）取完整心臟組織置于4%多聚甲醛水溶液中固定，室溫保存?zhèn)溆糜诓±硇螒B(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)。2）取心臟組織包裹于錫箔紙放入凍存管中，液氮速凍30 min 后，轉(zhuǎn)存入-80 ℃冰箱保存，用于反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot）。

1.3.2.1 病理組織觀察 將剪取的完整心臟置于4%多聚甲醛水溶液固定1 周，再經(jīng)改刀，組織脫水，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 切片，烤片；然后進(jìn)行Masson染色。將石蠟切片梯度乙醇脫蠟至水，經(jīng)鐵蘇木5 min、麗春紅酸性品紅5 min、磷鉬酸5 min、苯胺藍(lán)5 min、1%醋酸2 min，95%乙醇分化，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范，在倒置顯微鏡下觀察大鼠心肌纖維化情況。

1.3.2.2 用RT-PCR 檢測各組大鼠膠原蛋白（CollagenⅠ和Ⅲ）的mRNA 剪取大鼠心肌梗死邊緣區(qū)適量心臟組織，用TRIzol 法提取總RNA，然后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后用RT-PCR 檢測目的基因mRNA 表達(dá)水平變化情況。所用引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成見表1。

表1 用于實(shí)時(shí)RT-PCR 的引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time RT-PCR

1.3.2.3 用Western Blot 檢測各組大鼠TGF-β1/Smads 的蛋白表達(dá) 提取大鼠心臟組織蛋白，二喹啉甲酸法（BCA）試劑盒檢測各組大鼠心臟蛋白濃度，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液并95 ℃水浴10 min，使蛋白變性，聚偏氟乙烯（PVDF）轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h。一抗?jié)舛葹門GF-β1（1∶1 000，Proteintech，中國）、Smad3（1∶1 000，Proteintech，中國）、Smad7（1∶400，Boster，中國）、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，1 ∶1 000，Proteintech，中 國）。使 用VersaDoc 5000MP 多功能成像系統(tǒng)曝光成像，Quantity one 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD 法，若方差不齊采用Dunnett’s T3 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪丹利心丸對心肌梗死后CHF 大鼠心功能的影響 超聲心動圖結(jié)果顯示（圖1、表2），模型組心室腔較假手術(shù)組明顯擴(kuò)張。左心室心室律減弱，收縮功能發(fā)生障礙，而纈沙坦組和芪丹利心丸組上述情況明顯改善。與假手術(shù)組比較，模型組LVEF、LVFS、+dp/dt max 均顯著降低，室間隔厚度（IVST）明顯變薄，LVESD 顯著增厚，-dp/dt max 水平顯著升高。與模型組比較，纈沙坦組和芪丹利心丸組LVEF、LVFS、+dp/dt max 均升高，IVST 形態(tài)趨于正常，LVESD 顯著變薄，-dp/dt max 降低。結(jié)果提示芪丹利心丸能夠改善心功能、緩解心力衰竭大鼠心室重構(gòu)進(jìn)展，其中LVEF、LVFS、-dp/dt max 的改善以芪丹利心丸中劑量組效果更為明顯，而芪丹利心丸高劑量組改善IVST、LVESD、+dp/dt max 較其他給藥組效果更明顯。

圖1 心肌梗死后CHF 大鼠超聲心動圖Fig.1 Echocardiography of CHF rats after myocardial infarction

表2 各組大鼠心功能變化（x±s）Tab.2 Changes in cardiac function of each group of rats（x±s）

2.2 芪丹利心丸對心肌梗死后CHF 大鼠心肌纖維化的影響 Masson 染色顯示：心肌纖維呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間質(zhì)未見明顯藍(lán)色膠原纖維；模型組在心肌梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞排列紊亂、心肌細(xì)胞肥大，有大量藍(lán)色膠原纖維沉積，梗死邊緣區(qū)纖維化面積較大；芪丹利心丸各組藍(lán)色膠原纖維多呈分枝狀分布，藍(lán)染面積較模型組都有不同程度的減少，尤以芪丹利心丸中劑量組較為顯著。說明芪丹利心丸具有降低心肌細(xì)胞纖維化的功能。見圖2。

2.3 芪丹利心丸對病理性心肌膠原蛋白沉積的影響 模型組CollagenⅠ和Ⅲ的mRNA 表達(dá)均較假手術(shù)組顯著升高，芪丹利心丸各組CollagenⅠ和Ⅲ的mRNA 表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.05），見圖3。

2.4 芪丹利心丸對TGF-β1/Smads 蛋白表達(dá)的影響 模型組TGF-β1 蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01），而芪丹利心丸各組TGF-β1 蛋白表達(dá)水平較模型組顯著降低（P＜0.05），并且芪丹利心丸明顯減少TGF-β1 下游信號分子Smad3 表達(dá)（P＜0.05），另一方面，提高抑制型蛋白Smad7 的表達(dá)，見圖4。

圖2 光鏡下各組心肌組織纖維化改變（×200）Fig.2 Changes in myocardial fibrosis in each group under light microscopy（×200）

3 討論

心肌損傷（如心肌梗死）往往會使未死亡的心肌細(xì)胞適應(yīng)性改變和ECM 產(chǎn)生，導(dǎo)致心室的病理性重塑，心室收縮和舒張功能障礙[9]，主要病理特征為心室增大和LVEF 下降，且隨著時(shí)間的推移不斷惡化，LVEF 降低的心力衰竭是目前臨床主要常見心力衰竭類型[10]，另一方面，CHF 的中醫(yī)病機(jī)可以概括為：心氣虛—血瘀—水?！ㄐ模╆柼摚ㄐ臍馓摷又兀?，而且益氣活血利水法在臨床研究已被證實(shí)能提高臨床療效、LVEF、每搏輸出量、6 min 步行距離及患者生活質(zhì)量；降低左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、腦鈉肽（BNP）、N 末端前腦鈉肽（NT-proBNP）及C-反應(yīng)蛋白（CRP）[11-16]，說明益氣活血利水藥物能起到改善心功能、延緩因心肌纖維化而導(dǎo)致心力衰竭惡化的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明心肌梗死后CHF 大鼠LVEF、LVFS 明顯下降，心室腔擴(kuò)大，收縮功能障礙，而芪丹利心丸可以改善模型大鼠心功能，緩解心室重構(gòu)，對于心力衰竭患者可能更有針對性。

芪丹利心丸是以黃芪、黨參、丹參、葶藶子等益氣活血利水藥物化裁而成，黃芪、黨參為君補(bǔ)益脾、肺生化之氣，丹參活血化瘀為臣，另輔以葶藶子等利水養(yǎng)陰，臨床研究表明其具有改善心室重構(gòu)的作用，但機(jī)制仍未明確。TGF-β1/Smads 在組織纖維化進(jìn)展中扮演著重要角色，可涉及心、肺、肝、腎等組織纖維化病變[17-19]。其中，心肌梗死后死亡心肌細(xì)胞激活免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，使中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞向梗死區(qū)域募集浸潤，激活巨噬細(xì)胞等保護(hù)機(jī)制，巨噬細(xì)胞能分泌TGF-β1、TGF-β1 與TGF-β 受體I 型和II 型結(jié)合，可激活TGF-β1/Smads 通路，促使心肌成纖維細(xì)胞分化為肌成纖維細(xì)胞，在CHF 進(jìn)展中持續(xù)產(chǎn)生ECM，Ⅲ型膠原增加并逐步被剛性Ⅰ型膠原逐漸取代[2]。本研究顯示，心肌梗死后CHF 大鼠纖維化水平明顯加劇，Ⅰ/Ⅲ型膠原沉積增加，尤其以Ⅰ型膠原顯著，心肌組織TGF-β1 蛋白水平升高，下游受體調(diào)節(jié)Smad3 升高，抑制型Smad7 降低，TGF-β1/Smads 與纖維化水平呈正比，說明心肌梗死后CHF 大鼠TGFβ1/Smads 處于激活狀態(tài)并持續(xù)促進(jìn)ECM 沉積，而益氣活血利水中藥芪丹利心丸可能通過抑制TGF-β1/Smads 信號通路，降低TGF-β1 及下游信號Smad3表達(dá)，增強(qiáng)Smad7 的抑制作用，使病理性膠原合成減少，延緩心室重構(gòu)，緩解慢性心力衰竭進(jìn)展。

圖3 RT-PCR 檢測各組大鼠Collagen Ⅰ和Ⅲ的mRNA 表達(dá)水平Fig.3 RT-PCR detection of mRNA expression levels of Collagen I，III in each group

圖4 Western Blot 檢測各組大鼠TGF-β1/Smads 的蛋白表達(dá)Fig.4 Western Blot detection of protein expression of TGF-β1/Smads in each group

綜上所述，本研究表明芪丹利心丸對心肌纖維化進(jìn)展有抑制作用，能延緩CHF 進(jìn)程，對于LVEF降低的心力衰竭型患者可能效果更佳，益氣活血利水藥治療CHF 的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)或臨床研究仍有前景。