茶尺蠖絲氨酸蛋白酶基因EoSP1的克隆、時(shí)空表達(dá)及對(duì)饑餓的表達(dá)響應(yīng)

張新，陳成聰，杜琴，李喜旺，孫曉玲*

茶尺蠖絲氨酸蛋白酶基因的克隆、時(shí)空表達(dá)及對(duì)饑餓的表達(dá)響應(yīng)

張新1,2，陳成聰3，杜琴1,2，李喜旺1,2，孫曉玲1,2*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310008；3. 國(guó)家茶葉質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，福建 泉州 362400

絲氨酸蛋白酶是鱗翅目昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)中一類(lèi)重要的蛋白酶。本研究從茶尺蠖（）中克隆到一條絲氨酸蛋白酶基因并分析了其結(jié)構(gòu)特征和表達(dá)特性?；蛐蛄腥L(zhǎng)858?bp，編碼285個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為29.53?kDa，等電點(diǎn)為5.44。經(jīng)與其他絲氨酸蛋白酶比對(duì)，EoSP1含有保守的絲氨酸蛋白酶催化位點(diǎn)（H95，A161和S328）及蛋白互作結(jié)構(gòu)域，與蓓帶夜蛾（）中SPs親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步獲得了與EoSP1-GST融合蛋白大小接近的目的蛋白。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，在幼蟲(chóng)期的表達(dá)顯著高于成蟲(chóng)、蛹和卵期，并在幼蟲(chóng)中腸中特異性表達(dá)；饑餓處理后表達(dá)下降，恢復(fù)飼喂后表達(dá)量接近對(duì)照組。以上結(jié)果為茶尺蠖消化酶功能解析及抗蟲(chóng)新靶點(diǎn)的篩選提供了依據(jù)。

茶尺蠖；絲氨酸蛋白酶；克?。槐磉_(dá)分析

絲氨酸蛋白酶（Serine protease，SP）是一類(lèi)以絲氨酸為活性中心的蛋白水解酶家族，催化結(jié)構(gòu)域由組氨酸（His）、天冬氨酸（Asp）和絲氨酸（Ser）3個(gè)氨基酸殘基組成[1-2]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域的不同，SP可分為單結(jié)構(gòu)域和多結(jié)構(gòu)域蛋白，單結(jié)構(gòu)域蛋白主要發(fā)揮蛋白消化功能，而多結(jié)構(gòu)域蛋白常作用于各種生物過(guò)程中的分子識(shí)別[3-4]。根據(jù)酶切位點(diǎn)的不同，SP又可主要分為胰蛋白酶（Trypsin）、胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）、彈性蛋白酶（Elastase）及其他酶類(lèi)等[5-6]。其中，胰蛋白酶除包含His-Asp-Ser保守活性三聯(lián)體外，在蛋白序列的N端還含有保守氨基酸殘基IVGG，可水解多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)，是昆蟲(chóng)體內(nèi)含量最豐富的消化酶[7]；胰凝乳蛋白酶豐度僅次于胰蛋白酶，包含催化三聯(lián)體及胰凝乳蛋白酶所特有的結(jié)合口袋氨基酸殘基，可專(zhuān)一切割酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸形成的羧基端肽鍵[5]。目前，在動(dòng)物、植物和微生物等中均發(fā)現(xiàn)SP參與消化、先天免疫和發(fā)育等多種生理活動(dòng)[2,8-9]。

SP是鱗翅目昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)中最重要的消化酶，占總消化活性的95%以上[2,10-12]，由基因編碼。目前，的cDNA序列已經(jīng)從煙草天蛾（）、棉鈴蟲(chóng)（）、斜紋夜蛾（）、小菜蛾（）、家蠶（）和美國(guó)白蛾（）等多種鱗翅目昆蟲(chóng)中克隆獲得，并發(fā)現(xiàn)它們編碼的蛋白主要為胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶[13-14]。大量研究結(jié)果表明，在鱗翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)具有組織表達(dá)特異性，其編碼的蛋白參與昆蟲(chóng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收、免疫以及對(duì)饑餓的耐受性等多個(gè)生理過(guò)程。例如，煙草夜蛾、斜紋夜蛾和家蠶的基因在中腸中特異表達(dá)，饑餓脅迫后會(huì)引起部分基因表達(dá)下調(diào)[15-17]；美國(guó)白蛾在取食量較大的時(shí)期表達(dá)量顯著高于取食量較小的時(shí)期，并且取食喜樹(shù)后的表達(dá)量高于其他寄主植物[18]；家蠶在病原微生物BmNPV入侵過(guò)程中參與免疫應(yīng)答[19-20]；東方粘蟲(chóng)（）和主要表達(dá)于中腸，饑餓脅迫后二者表達(dá)均受抑制，但受蛻皮激素誘導(dǎo)上調(diào)，則主要響應(yīng)蘇云金芽孢桿菌的刺激[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，沉默的大豆二化螟（）幼蟲(chóng)體重增長(zhǎng)顯著變慢，死亡率顯著升高[22]。類(lèi)似地，植物源絲氨酸蛋白酶抑制劑通過(guò)與昆蟲(chóng)體內(nèi)的SP發(fā)生反應(yīng)使其失活，從而顯著阻滯幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至降低成蟲(chóng)的繁殖能力[12, 23]。因此，作為潛在的防控靶標(biāo)基因已經(jīng)引起科研工作者的廣泛關(guān)注。

茶尺蠖（）屬鱗翅目（Lepidoptera）尺蠖蛾科（Geometridae），是危害茶樹(shù)（）的主要害蟲(chóng)之一，主要以幼蟲(chóng)取食茶樹(shù)葉片，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)可造成樹(shù)勢(shì)衰敗及茶葉絕收[24-25]。目前，對(duì)其有效的防治仍依賴于化學(xué)農(nóng)藥。然而，化學(xué)農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致了農(nóng)藥殘留、害蟲(chóng)抗藥性以及次期性害蟲(chóng)大發(fā)生等諸多問(wèn)題[26]。因此，開(kāi)發(fā)茶尺蠖的綠色防控技術(shù)已成為茶樹(shù)植保工作的迫切需求。通過(guò)對(duì)茶尺蠖體內(nèi)重要消化酶的研究將有助于理解茶尺蠖的營(yíng)養(yǎng)利用機(jī)制，可以為茶尺蠖綠色防控技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。遺憾的是，目前尚無(wú)茶尺蠖幼蟲(chóng)基因的相關(guān)報(bào)道。鑒于此，本研究從茶尺蠖幼蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得基因片段的轉(zhuǎn)錄本序列，利用RACE技術(shù)對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行克隆，并利用原核表達(dá)方法確定克隆到的基因能夠編碼大小一致的蛋白，繼而采用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)對(duì)在茶尺蠖不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位，以及饑餓和回補(bǔ)食物后的表達(dá)量變化情況進(jìn)行了研究，擬為該基因的利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

供試的茶尺蠖幼蟲(chóng)采自浙江省杭州市西湖區(qū)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)茶園（N 30°10'，E 120°5'），以新鮮茶樹(shù)嫩梢飼養(yǎng)于人工氣候箱內(nèi)[(26±1)℃，(70±5)%，14L∶10D]。繁殖兩代后用于試驗(yàn)。各處理方法如下：

1.1.1 不同發(fā)育時(shí)期

分別收集產(chǎn)卵后1?d的卵（200粒）、孵化第2天的1齡幼蟲(chóng)（200頭）、蛻皮第2天的2齡幼蟲(chóng)（50頭）；蛻皮第2天的3齡幼蟲(chóng)（5頭）；蛻皮第2天的4、5齡幼蟲(chóng)（1頭）、化蛹第2天的雌蛹和雄蛹（1個(gè)）、羽化第2天的雌、雄成蟲(chóng)（1頭），液氮冷凍后于–80℃冰箱保存。每個(gè)樣品8個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.1.2 不同組織部位

實(shí)體顯微鏡（OLIMPUS）下解剖茶尺蠖4齡幼蟲(chóng)，分別采集80頭茶尺蠖幼蟲(chóng)的中腸、唾液腺、脂肪體、表皮和血淋巴，液氮冷凍后于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｃ款?lèi)組織樣品取8個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.1.3 饑餓處理

中腸組織：對(duì)照組為飼喂茶樹(shù)葉片的4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)，饑餓處理組同為4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)但不飼葉片，饑餓24?h。饑餓24?h后再飼喂茶樹(shù)葉片24?h的4齡幼蟲(chóng)為先饑餓-再飼喂組。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

蟲(chóng)體：對(duì)照組為飼喂茶樹(shù)葉片的4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)，饑餓處理組同為4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)但不飼以葉片。分別于處理后的3、6、12、24?h和48?h后取樣；饑餓24?h后再飼喂茶樹(shù)葉片24?h的4齡幼蟲(chóng)為先饑餓-再飼喂組。每個(gè)處理設(shè)8個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 RNA提取

參照Promega總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)樣品進(jìn)行總RNA提取。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，并使用Nano Drop ND-2000微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo，美國(guó)）測(cè)定濃度。參照Prime Script RT Reagent（Takara，日本）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1?μg總RNA進(jìn)行cDNA合成，用于后續(xù)基因克隆和表達(dá)分析。

1.3 EoSP1基因的克隆

從本實(shí)驗(yàn)室茶尺蠖幼蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中得到1個(gè)SP基因片段的轉(zhuǎn)錄本序列，根據(jù)此序列分別設(shè)計(jì)特異性RACE引物（表1），以茶尺蠖幼蟲(chóng)cDNA為模板，采用高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase（TAKARA，大連）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取基因全序列。PCR反應(yīng)體系為：cDNA 1.0?μL、Max 25?μL、上下游引物各1.5?μL、ddH2O 21?μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3?min；98℃變性10?s，55℃退火30?s，72℃延伸30?s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min，4℃保存。采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RCR產(chǎn)物，將單一目標(biāo)條帶切膠回收，使用pClone007 Blunt Vector Kit（TSINGKE，北京）用于目的片段與克隆載體的構(gòu)建，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，挑選單克隆進(jìn)行菌液PCR，陽(yáng)性克隆送測(cè)，引物合成和測(cè)序均由北京擎科生物科技有限公司（杭州）完成。

1.4 生物信息學(xué)分析

通過(guò)Softberry在線軟件（http://softberry.com）的FGENESH功能對(duì)全長(zhǎng)進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（Open reading frame，ORF）及氨基酸序列分析；使用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam）在線預(yù)測(cè)EoSP1的氨基酸組成、分子量和等電點(diǎn)特征；通過(guò)PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/introduction）分析EoSP1的蛋白結(jié)構(gòu)；在NCBI（https://www. ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已登錄其他昆蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶氨基酸序列，采用MEGA5.0軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining tree）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.5 原核表達(dá)載體構(gòu)建及蛋白純化

利用EoSP1-pGEX-F和EoSP1-pGEX-R一對(duì)引物對(duì)（表1）擴(kuò)增獲得包含BamH Ⅰ和Sma Ⅰ多克隆酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)序列，通過(guò)酶切連接到表達(dá)載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆。將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（Rosetta）菌株中，挑選陽(yáng)性克隆接種于液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD值達(dá)到0.4~0.6，加入終濃度1?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒表達(dá)，于37℃，200?r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)2?h，收集菌體。分別收集誘導(dǎo)前后各1?mL菌液，將菌體重懸于100?μL SDS上樣緩沖液中，煮沸5?min變性，室溫12?000?r·min-1離心5?min后，取25?μL上清液進(jìn)行SDS-PAGE（10%濃度）檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

將上述條件擴(kuò)大培養(yǎng)至100?mL LB菌液，將誘導(dǎo)后的菌液于4℃下，轉(zhuǎn)速12?000?r·min-1離心10?min收集至50?mL離心管中，加入15?mL 0.1?mol·L-1的Tris-HCl（pH=8.0）緩沖液重懸菌體。對(duì)重懸菌體進(jìn)行超聲破碎（超聲5?s，停5?s，共15?min），結(jié)束后于4℃，12?000?r·min-1離心30?min。參考GST標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（GST-tag Protein Purification Kit，碧云天，上海）進(jìn)行蛋白純化，利用梯度透析法對(duì)純化后的蛋白進(jìn)行復(fù)性，對(duì)復(fù)性后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.6 定量分析

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS Statistics 20對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同發(fā)育時(shí)期、不同組織部位以及饑餓后再飼喂樣品中相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性采用單因素方差分析法（Tukey’s多重檢驗(yàn)）進(jìn)行比較；饑餓與對(duì)照組茶尺蠖樣品中相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性采用Student'stest進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 EoSP1全長(zhǎng)克隆及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

基因ORF全長(zhǎng)為858?bp，編碼285個(gè)氨基酸殘基（圖1）；利用Protparam對(duì)EoSP1氨基酸序列的理化性質(zhì)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，EoSP1推導(dǎo)氨基酸殘基數(shù)為285，分子量為29.53?kDa，理論等電點(diǎn)pI為5.44，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為36.98，脂溶指數(shù)為91.68，平均疏水性指數(shù)為0.214。PSIPRED Server預(yù)測(cè)結(jié)果表明，EoSP1由6個(gè)α螺旋、16個(gè)β折疊和一些無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成。此外，發(fā)現(xiàn)EoSP1的N末端疏水區(qū)包含從第1位開(kāi)始的18個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，預(yù)測(cè)酶切位點(diǎn)為18、19位，表明EoSP1是分泌型蛋白（圖2）。

表1 引物信息

圖1 EoSP1核苷酸序列及其預(yù)測(cè)氨基酸序列

2.2 EoSP1蛋白結(jié)構(gòu)及進(jìn)化樹(shù)分析

將EoSP1同其他已知昆蟲(chóng)的絲氨酸蛋白酶進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)EoSP1含有絲氨酸蛋白酶的3個(gè)保守催化活性位點(diǎn)（H95，A161，S328）。活化相關(guān)元件包含RIVGG，TAAHC和GDSGSAL序列，以及3對(duì)二硫鍵的半胱氨酸殘基等也是保守存在于EoSP1中（圖3）。進(jìn)一步保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)EoSP1屬于類(lèi)胰蛋白酶類(lèi)（Trypsin-like）的絲氨酸蛋白酶。

與其他已知昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶序列進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明，EoSP1與蓓帶夜蛾和小地老虎（）的絲氨酸蛋白酶家族成員親緣關(guān)系較近，而與大紅斑蝶（）親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 EoSP1原核表達(dá)及純化

在37℃，0.1?mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)條件下促使融合載體表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，誘導(dǎo)后泳道中有1條單一明顯、分子質(zhì)量略高于50?kDa的蛋白條帶（圖5，泳道2）。EoSP1蛋白分子量預(yù)測(cè)為29.53?kDa，融合27?kDa GST標(biāo)簽后約為57?kDa，誘導(dǎo)條帶大小接近重組蛋白的預(yù)測(cè)分子量。超聲后發(fā)現(xiàn)EoSP1-GST重組蛋白以包涵體形式存在（圖5，泳道3—4），通過(guò)對(duì)沉淀中的包涵體進(jìn)行蛋白質(zhì)變性、復(fù)性，最終純化到目的蛋白（圖5，泳道5）。由此證明，所編碼的蛋白與EoSP1蛋白的預(yù)測(cè)分子量相當(dāng)。

圖2 EoSP1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4 EoSP1在茶尺蠖不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特征

在整個(gè)茶尺蠖生活史中，在1~4齡茶尺蠖幼蟲(chóng)中的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于5齡幼蟲(chóng)、蛹期、成蟲(chóng)期和卵期，2齡幼蟲(chóng)的相對(duì)表達(dá)量是卵期的2?600倍以上；在幼蟲(chóng)期，1~4齡幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量顯著高于5齡；在不同蟲(chóng)態(tài)中，預(yù)蛹中的表達(dá)量顯著高于蛹期、成蟲(chóng)和卵等其他蟲(chóng)態(tài)（圖6）。

2.5 EoSP1在不同組織中的表達(dá)特征

在中腸、脂肪體、唾液腺和血淋巴中均有表達(dá)，在中腸中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他4個(gè)組織；而在表皮、脂肪體、唾液腺和血淋巴中的表達(dá)量間不存在顯著差異（圖7）。

2.6 饑餓脅迫下EoSP1的表達(dá)響應(yīng)

與對(duì)照相比，饑餓24?h幼蟲(chóng)中腸內(nèi)的相對(duì)表達(dá)顯著降低，恢復(fù)飼喂后中腸內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照之間不存在顯著差異（圖8-A）。

饑餓12?h，處理組幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照；饑餓24?h，處理組幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的2.7倍；饑餓48?h，饑餓處理的幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的2.3倍，恢復(fù)飼喂組茶尺蠖幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量基本相當(dāng)，但是顯著低于饑餓處理48?h茶尺蠖幼蟲(chóng)體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量（圖8-B）。

注：ACR15986.2：蓓帶夜蛾；AFM28249.1：煙草夜蛾；AAX39409.1：家蠶；AAV33653.1：斑實(shí)夜蛾

圖4 EoSP1與其他昆蟲(chóng)SPs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

注：M：蛋白分子量標(biāo)記；1：對(duì)照；2：IPTG誘導(dǎo)后；3：超聲破碎上清；4：超聲破碎沉淀；5：純化目的蛋白

Note: M: Protein Marker. 1: Control. 2: Induced by IPTG. 3: Supernatant after sonification. 4: Sediment after sonification. 5: Purified protein

注：M：蛋白分子量標(biāo)記；1：對(duì)照；2：IPTG 誘導(dǎo)后；3：超聲破碎上清；4：超聲破碎沉淀；5：純化目的蛋白

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，單因素方差分析（Tukey’s多重檢驗(yàn)），不同大寫(xiě)字母代表EoSP1的相對(duì)表達(dá)量在茶尺蠖生活史的不同時(shí)期具有顯著性差異（P<0.05）；不同小寫(xiě)字母代表EoSP1的相對(duì)表達(dá)量在幼蟲(chóng)不同齡期（虛線左側(cè)）或不同蟲(chóng)態(tài)之間（虛線右側(cè)）具有顯著性差異（P<0.05）

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理之間差異具有顯著性（Tukey’s多重檢驗(yàn)，P<0.05）

注：A：中腸；B：蟲(chóng)體。Ⅰ：對(duì)照；Ⅱ：饑餓24?h；Ⅲ：饑餓24?再飼喂24?h。*表示饑餓處理前后間差異顯著（Student’s t檢驗(yàn)，P<0.05）；柱上字母表示不同處理之間差異具有顯著性（Tukey’s多重檢驗(yàn)，P <0.05）

3 討論

絲氨酸蛋白酶作為鱗翅目昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)中最重要的消化水解酶，不僅參與食物中蛋白質(zhì)的水解和其他蛋白質(zhì)的合成，還與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、免疫、蛻皮和變態(tài)等生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)[1]。例如，煙草天蛾卵中含有的多種與黑化和抗菌肽合成相關(guān)的絲氨酸蛋白酶參與抵御細(xì)菌感染，構(gòu)成了煙草天蛾卵的先天免疫系統(tǒng)[27]。近年來(lái)，還有研究發(fā)現(xiàn)昆蟲(chóng)對(duì)產(chǎn)生抗性可能依賴于昆蟲(chóng)腸道中蛋白酶水平或類(lèi)型的變化[2]。目前，科研工作者已從多種鱗翅目昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了絲氨酸蛋白酶家族的存在，如甜菜夜蛾SeCT34、家蠶BmSP25和菜青蟲(chóng)PrCT1等，通過(guò)對(duì)該類(lèi)蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能分析，鑒定到SP家族的保守結(jié)構(gòu)域和催化位點(diǎn)[18,20,22,28-30]。本文從茶尺蠖幼蟲(chóng)體內(nèi)克隆到1條絲氨酸蛋白酶的cDNA全長(zhǎng)序列（圖1），并發(fā)現(xiàn)所編碼的氨基酸N端含有1個(gè)由18個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽（圖2），這與已報(bào)道的BmSP25，PrCT1等絲氨酸蛋白酶是分泌型蛋白的結(jié)構(gòu)一致[28]。通過(guò)與蓓帶夜蛾等已知昆蟲(chóng)絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列比對(duì)，鑒定到EoSP1存在高度保守的H95-A161-S328催化三聯(lián)活性位點(diǎn)，以及3對(duì)半胱氨酸殘基（圖3）。此外，EoSP1還包含胰蛋白酶蛋白N端保守氨基酸殘基IVGG，表明其屬于絲氨酸蛋白酶家族中的類(lèi)胰蛋白酶亞族（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與序列比對(duì)結(jié)果一致，茶尺蠖EoSP1與蓓帶夜蛾和小地老虎的SPs同源性較高（圖4）。在原核系統(tǒng)中誘導(dǎo)表達(dá)了EoSP1-GST重組蛋白，其大小與預(yù)測(cè)的EoSP1蛋白分子量（約29.53?kDa）一致，表明已克隆獲得的可以正常翻譯和表達(dá)（圖5）。綜上所述，本文克隆得到的是編碼絲氨酸蛋白酶家族基因成員之一，所編碼的絲氨酸蛋白酶屬于類(lèi)胰蛋白酶亞族，為分泌型蛋白。

已有研究結(jié)果表明，絲氨酸蛋白酶在鱗翅目昆蟲(chóng)不同發(fā)育階段和不同組織中的表達(dá)與其生物學(xué)功能緊密相關(guān)[10,16,31]。本研究發(fā)現(xiàn)，在茶尺蠖幼蟲(chóng)中腸中的表達(dá)量顯著高于脂肪體、血淋巴和唾液腺等其他組織；并且，在1~4齡幼蟲(chóng)階段的表達(dá)量最高，在5齡幼蟲(chóng)、預(yù)蛹和蛹期表達(dá)量顯著下降，在成蟲(chóng)期及卵期幾乎不表達(dá)（圖6）。這一研究結(jié)果表明，所編碼的蛋白酶參與了茶尺蠖幼蟲(chóng)對(duì)植物蛋白質(zhì)的水解、消化和吸收過(guò)程，推測(cè)其在調(diào)控茶尺蠖的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖過(guò)程中具有重要作用。類(lèi)似的研究結(jié)果在美國(guó)白蛾、小菜蛾絲氨酸中也有發(fā)現(xiàn)，但是二者高齡幼蟲(chóng)的表達(dá)量均顯著高于低齡幼蟲(chóng)[18,32]，與之不同的是，茶尺蠖5齡幼蟲(chóng)進(jìn)入暴食期，但是的相對(duì)表達(dá)量卻顯著低于1~4齡幼蟲(chóng)（圖6）。究其原因，這可能與茶尺蠖幼蟲(chóng)的取食特點(diǎn)和不同老嫩程度葉片中的蛋白或者其他代謝物含量改變相關(guān)[33]。茶尺蠖5齡幼蟲(chóng)進(jìn)入暴食期，主要以茶樹(shù)老葉為食。有研究表明，相較于嫩葉或成熟葉，茶樹(shù)老葉中蛋白含量明顯下降[34]。因此，5齡幼蟲(chóng)水解和消化蛋白的需求亦會(huì)降低，相應(yīng)地，主要負(fù)責(zé)消化蛋白的絲氨酸蛋白酶的表達(dá)量也下降。此外，老葉與嫩葉之間生化成分的差異也可能會(huì)影響茶尺蠖幼蟲(chóng)體內(nèi)絲氨酸蛋白酶的表達(dá)[35]。

如前所述，絲氨酸蛋白酶在鱗翅目昆蟲(chóng)對(duì)植物蛋白質(zhì)的水解和吸收過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[19,32]。基于此，眾多科研工作者對(duì)饑餓處理后鱗翅目昆蟲(chóng)中腸內(nèi)基因的表達(dá)響應(yīng)特征進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)饑餓昆蟲(chóng)中腸中基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于正常取食的昆蟲(chóng)；重新飼喂后，基因的表達(dá)量在有的昆蟲(chóng)中可以恢復(fù)至正常取食的幼蟲(chóng)水平，但也在個(gè)別昆蟲(chóng)則表現(xiàn)出不可逆的抑制作用[15,16,31]。例如，饑餓處理后，煙草天蛾絲氨酸蛋白酶的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，而同家族的和的表達(dá)量則不受影響，重新飼喂后，的表達(dá)量未恢復(fù)至正常取食的幼蟲(chóng)水平[15]；斜紋夜蛾絲氨酸蛋白酶Slctlp1和Slctlp2的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平在饑餓處理后皆顯著下調(diào)，但在重新飼喂后，Slctlp2在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平都恢復(fù)至正常取食的幼蟲(chóng)水平，而Slctlp1只在蛋白水平有所恢復(fù)[16,31]。本研究中，與對(duì)照相比，饑餓處理后茶尺蠖幼蟲(chóng)中腸內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量顯著下降，恢復(fù)飼喂后中腸內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照幼蟲(chóng)的表達(dá)量基本一致（圖8），這與斜紋夜蛾的研究結(jié)果相似。這一結(jié)果進(jìn)一步表明，的表達(dá)與茶尺蠖的進(jìn)食量密切相關(guān)，從而推測(cè)其在茶尺蠖中腸中發(fā)揮著重要的消化作用。有趣的是，饑餓處理誘導(dǎo)了茶尺蠖幼蟲(chóng)整個(gè)蟲(chóng)體中相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)，并且恢復(fù)飼喂后茶尺蠖幼蟲(chóng)整體的表達(dá)量與對(duì)照組幼蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)量基本相當(dāng)。這說(shuō)明除了參與茶尺蠖幼蟲(chóng)對(duì)植物蛋白質(zhì)的水解、消化和吸收以外，可能還參與蟲(chóng)體免疫調(diào)節(jié)等其他重要的生理過(guò)程。在今后的研究中，我們將利用RNA干擾技術(shù)對(duì)的生理功能進(jìn)行研究。

[1] Jiang H B, Michael R Kanost. The clip-domain family of serine proteinases in arthropods [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2000, 30(2): 95-105.

[2] Srinivasan A, Giri A P, Gupta V S. Structural and functional diversities in lepidopteran serine proteases [J]. Cell Mol Biol Lett, 2006, 11(1): 132-154.

[3] Jeremy Rossa, Michael R Kanostb, Wang Y. Serine proteases and their homologs in thegenome: an initial analysis of sequence conservation and phylogenetic relationships [J]. Gene, 2003, 304: 117-131.

[4] Veillard F, Troxler L, Reichhart J M.clip-domain serine proteases: Structure, function and regulation [J]. Biochimie, 2016, 122: 255-269.

[5] Colebatch G, Cooper P, East P. cDNA cloning of a salivary chymotrypsin-like protease and the identification of six additional cDNAs encoding putative digestive proteases from the green mirid,(Hemiptera: Miridae) [J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32(9): 1065-1075.

[6] 王鏡巖, 朱圣庚, 徐長(zhǎng)發(fā). 生物化學(xué)[M]. 第三版. 北京: 高等教育出版社, 2002: 405.

[7] Joseph Kraut. Serine proteases: Structure and mechanism of catalysis [J]. Ann. Rev. Biochem, 1977, 46: 331-358.

[8] Page M J, Cera E Di. Serine peptidases: classification, structure and function [J]. Cell Mol Life Sci, 2008. 65(7/8): 1220-1236.

[9] Hedstrom L. Serine Protease Mechanism and Specificity [J]. Chemical Reviews, 2002, 102(12): 4501-4523.

[10] Lomate, P R, Mahajan N S, Kale, et al. Identification and expression profiling ofmicroRNAs and their possible role in the regulation of digestive protease genes [J]. Insect Biochem Mol Biol, 2014, 54: 129-137.

[11] Anisuzzaman, Islam M K, Alim M A, et al. Longistatin is an unconventional serine protease and induces protective immunity against tick infestation [J]. Mol Biochem Parasitol, 2012, 182(1/2): 45-53.

[12] Srinivasan A, Ashok P Giri1, Abhay M Harsulkar, et al. A Kunitz trypsin inhibitor from chickpea (L.) that exerts anti-metabolic effect on podborer () larvae [J]. Plant Mol Biol, 2005, 57(3): 359-374.

[13] 李莉莉, 周曉群, 趙奎軍, 等. 苜蓿夜蛾絲氨酸蛋白酶基因cDNA序列的克隆與原核表達(dá)研究[J]. 應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2016, 53(4): 706-715.

[14] 周曉群, 高艷玲, 趙奎軍, 等. 苜蓿夜蛾中腸絲氨酸蛋白酶cDNA 的克隆、序列分析及原核表達(dá)[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2014, 57(9): 1008-1017.

[15] Broehan G, Kemper M, Driemeier D, et al. Cloning and expression analysis of midgut chymotrypsin-like proteinases in the tobacco hornworm [J]. J Insect Physiol, 2008, 54(8): 1243-1252.

[16] Zhang C, Zhou D H, Zheng S C, et al. A chymotrypsin-like serine protease cDNA involved in food protein digestion in the common cutworm,: Cloning, characterization, developmental and induced expression patterns, and localization [J]. J Insect Physiol, 2010, 56(7): 788-799.

[17] 馮一璐, 傅曉斌, 吳帆, 等.茶尺蠖信息素結(jié)合蛋白PBP2的基因克隆、原核表達(dá)及其結(jié)合功能[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50(3): 504-512.

[18] 趙旭東, 孫宇航, 陳昌宇, 等. 美國(guó)白蛾絲氨酸蛋白酶基因的克隆、時(shí)空表達(dá)及對(duì)取食不同寄主植物的表達(dá)響應(yīng)[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2019, 62(2): 160-169.

[19] Wang R X, Tong X L, Gai T T, et al. A serine protease homologueinduces a short and fat body shape in silkworm [J]. Insect Mol Biol, 2018, 27(3): 319-332.

[20] 張永紅, 朱峰, 唐芬芬, 等. 家蠶絲氨酸蛋白酶基因BmSP25轉(zhuǎn)錄分析及其免疫響應(yīng)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 48(6): 1093-1098.

[21] Liu Q Y, Li M G, Liu X F, et al. Characterization of trypsin-like and chymotrypsin-like serine proteases from midgut ofWalker [J]. Arch Insect Biochem Physiol, 2016, 92(3): 173-191.

[22] Fan L M, Rui X R, Yang L, et al. RNA interference mediated serine protease gene () knockdown affects growth and mortality in the soybean pod borer (Lepidoptera: Olethreutid) [J]. Florida Entomologist, 2017, 100(3): 607-615.

[23] Tamhane V A, Chougule N P, Giri A P, et al.andeffect ofproteinase inhibitors ongut proteinases [J]. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects, 2005, 1722(2): 156-167.

[24] Yang Z W, Duan X N, Jin S, et al. Regurgitant derived from the tea geometridsuppresses wound-induced polyphenol oxidases activity in tea plants [J]. Journal of Chemical Ecology, 2013, 39(6): 744-751.

[25] Huang C, Zhang J, Zhang X, et al. Two new polyphenol oxidase genes of tea plant () respond differentially to the regurgitant of tea geometrid,[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(8): 2414. DOI: 10.3390/ijms19082414.

[26] Sun X L, Li X W, Xin Z J, et al. Development of synthetic volatile attractant for malemoths [J]. Journal of Integrative Agriculture, 2016, 15(7): 1532-1539.

[27] Gorman M J, Kankanala P, Kanost M R. Bacterial challenge stimulates innate immune responses in extra-embryonic tissues of tobacco hornworm eggs [J]. Insect Molecular Biology, 2004, 13(1): 19-24.

[28] 張嫻, 李超林, 鄭喬木, 等. 菜青蟲(chóng)胰凝乳蛋白酶基因PrCT1的克隆及表達(dá)分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 48(9): 74-81.

[29] Chen C X, Yan Y, Yang H, et al. Cloning of two clip-domain serine protease genes and their expression in response to exogenous hormone and immune challenge in(Coleoptera: Anobiidae) [J]. Acta Entomologica Sinica, 2019, 62(5): 535-546.

[30] He W Y, Zheng Y P, Tang L, et al. Cloning, expression and localization of a trypsin-like serine protease in the spruce budworm,[J]. Insect Science, 2009, 16(6): 455-464.

[31] Zhan Q L, Zheng S C, Feng Q L, et al. A midgut-specific chymotrypsin cDNA () from: cloning, characterization, localization and expression analysis [J]. Arch Insect Biochem Physiol, 2011, 76(3): 130-143.

[32] Shi M, Zhu N, Yi Y, et al. Four serine protease cDNAs from the midgut ofand their proteinase activity are influenced by the endoparasitoid,[J]. Arch Insect BiochemPhysiol, 2013, 83(2): 101-114.

[33] 高旭暉, 宛曉春, 楊云秋, 等. 茶尺蠖生物學(xué)習(xí)性研究[J]. 植物保護(hù), 2007, 33(3): 110-113.

[34] 郭蕭, 王曉慶, 彭萍, 等. 茶樹(shù)不同成熟度葉片對(duì)茶尺蠖發(fā)育適合度的影響[J]. 茶葉科學(xué), 2012, 32(3): 229-235.

[35] Fang R, Sally P Redfern, Don Kirkup, et al. Variation of theanine, phenolic, and methylxanthine compounds in 21 cultivars ofharvested in different seasons [J]. Food Chemistry, 2017, 220: 517-526.

Cloning and Expression Analysis of Serine Proteasein Tea Geometrid () and Its Response to Starvation

ZHANG Xin1,2, Chen Chengcong3, DU Qin1,2, LI Xiwang1,2, SUN Xiaoling1,2*

1. Tea Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. Key Laboratory of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Hangzhou 310008, China; 3. National Research Center of Engineering and Technology of Tea Quality and Safety, Quanzhou 362400, China

Serine protease plays an important role in the digestion process of Lepidoptera insects. In this study, we cloned a serine protease encoding genefromand analyzed its basic characteristics and expression patterns. The coding sequence ofis 858?bp, encoding 285 amino acid residues with deduced molecular weight of 29.53?kDa and isoelectric point of 5.44. Compared with other serine proteases, EoSP1 contains conserved serine protease catalytic sites (H95, A161and S328) and protein interaction domains, and shows the closest relationship with SPs from. Further, EoSP1-GST fusion protein similar to the predicted size was purified fromcells. qRT-PCR analysis showed that the expression level ofwas much higher in larvae than that in adults, pupae and eggs, and expressed in midgut of larvae specifically.was down-regulated by starvation treatment, and the expression level was change back to that of control group after re-feeding. The above results provide a basis for the function analysis of digestive enzyme and screening of new insect-resistance targets in.

, serine protease, cloning, expression pattern

S435.711；Q52

A

1000-369X(2019)06-669-12

2019-10-08

2019-10-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31272053）、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（1610212017017、1610212018004）國(guó)家茶葉質(zhì)量安全工程技術(shù)中心開(kāi)放課題基金項(xiàng)目（2018NTQS0102）

張新，助理研究員，主要從事茶樹(shù)抗蟲(chóng)機(jī)理研究，xinzhang@tricaas.com。

xlsun1974@163.com