同名經(jīng)部位對(duì)稱的少澤、至陰穴刺血法對(duì)孕鼠泌乳素、乳腺組織形態(tài)及子宮組織Cx-43蛋白表達(dá)的影響*

劉 佳，李子騰，鄭 君

(1.濟(jì)南市歷城區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250100; 2.棗莊市薛城區(qū)中醫(yī)院，山東 棗莊 277000; 3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250013)

同名經(jīng)配穴法是指在同名經(jīng)“同氣相通”指導(dǎo)下，配伍手足同名經(jīng)腧穴的方法[1]。臨床治療中選用腧穴的部位對(duì)稱或部位形態(tài)相近其功能應(yīng)當(dāng)有相似之處或有很大的關(guān)聯(lián)影響性[2]，這為“同氣相通”理論賦予了形態(tài)學(xué)上的意義，但至今缺乏現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)，對(duì)“同氣相通”理論的探討多限于思維方式和哲學(xué)層面的研究,造成其在具體指導(dǎo)臨床時(shí)常缺乏準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

少澤穴與至陰穴分別為同名手足太陽(yáng)經(jīng)的井穴，少澤是臨床通乳的經(jīng)驗(yàn)效穴，至陰是臨床轉(zhuǎn)胎的經(jīng)驗(yàn)效穴。兩者所處部位相似，部位的形態(tài)也相似，功能皆指向女性孕產(chǎn)疾患。本研究選取同名經(jīng)部位對(duì)稱的少澤、至陰穴點(diǎn)刺放血，觀察不同穴位刺激對(duì)孕大鼠的泌乳素影響，同時(shí)，通過(guò)手足同名經(jīng)井穴的效應(yīng)差異，探討“同氣相通”理論的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)，提高經(jīng)典理論的現(xiàn)代認(rèn)同度，也能為臨床調(diào)整女性內(nèi)分泌激素提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，清潔級(jí)(濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供)，體質(zhì)量(250±20)g，飼養(yǎng)于山東省中醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)溫度24～26℃，相對(duì)濕度50%～70%，常規(guī)光照與黑暗光照交替下喂養(yǎng)，食物飲水充足。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛溶液;低速自動(dòng)平衡微型離心機(jī)(DT5-3,北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);純水儀(AJC-0501-P);紫外分光光度計(jì)(752-P);電泳儀(DYY-6C);感光膠片;微型旋渦混合器(WH-2);水浴鍋(TL-420D);10 μL槍(DS74948);100 μL槍(DX15487);1 000 μL槍(DS93879);冰箱(BCD-186);全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀(Maglumi 800);泌乳素檢測(cè)試劑盒(化學(xué)發(fā)光,深圳新產(chǎn)業(yè));掃描儀(V300);灰度分析軟件(alphaEaseFC);圖像分析軟件(Adobe PhotoShop);RIPA裂解液(G2002)、50×cooktail(G2006)、PMSF(100 mm,G2008)、磷酸化蛋白酶抑制劑(G2007)、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒(G2026)、5×蛋白上樣緩沖液(G2013)、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(G2003)、顯影定影試劑(G2019)(武漢賽維爾生物科技);華鴻牌一次性采血針。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)孕鼠造模與分組

將68只(雌鼠50只，雄鼠18只)Wistar大鼠雌雄分籠于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中適應(yīng)性養(yǎng)殖1周，將雌鼠與雄鼠按照1∶2的比例合籠喂養(yǎng)，自然交配受孕，采取托盤(pán)陰栓檢查法篩選孕鼠，發(fā)現(xiàn)受孕后將受孕鼠單籠飼養(yǎng)，當(dāng)日記為妊娠第1天，陰栓數(shù)多為1～4個(gè)，直徑約3～5 mm，色乳白或淡紅，將36只孕鼠隨機(jī)分為模型組A1(少澤組)、A2(至陰組)、A3(少澤、至陰組)，模型對(duì)照組B(懷孕不針組)，每組9只；空白對(duì)照組C為不懷孕不針刺組9只；5只備用。

2.2 針刺方法

穴位定位參照文獻(xiàn)大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜[3]。穴位常規(guī)消毒，以一次性采血針于少澤、至陰穴點(diǎn)刺，使出血5滴，自孕1天起，每日1次，連續(xù)7天。模型A1組取穴少澤穴，模型A2組取穴至陰穴，模型A3組取穴少澤、至陰穴；模型對(duì)照組B與空白對(duì)照組C也進(jìn)行抓取、固定，但不針刺，飼養(yǎng)7天。

2.3 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

2.3.1 血清泌乳素(PRL)測(cè)定 孕鼠妊娠第8天，將大鼠麻醉后，暴露腹腔，采腹腔靜脈血5 mL后使用低速自動(dòng)平衡微型離心機(jī)(DT5-3)離心(3 000 r/min)分離，-80℃保存，化學(xué)發(fā)光法測(cè)定PRL含量。

2.3.2 病理檢測(cè) 將大鼠處死解剖后，取乳腺，立即固定，進(jìn)行常規(guī)切片、HE染色，觀察乳腺的形態(tài)學(xué)變化。

2.3.3 縫隙連接蛋白43(Cx-43)檢測(cè) 在冰上取大鼠子宮(剝離胎兒及胎兒附屬組織)，經(jīng)液氮迅速冷凍后移至-80℃低溫冰箱保存待測(cè)，按常規(guī)蛋白質(zhì)印記法(Western Blot)檢測(cè)子宮組織中縫隙連接蛋白43(Connexin 43,Cx-43)的表達(dá)，提取蛋白，進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，按實(shí)驗(yàn)安排配制分離膠、濃縮膠，加入TEMED后立即搖勻灌膠，加足夠的電泳液后上樣電泳。將樣品加入電泳孔中電泳，濃縮膠電壓75 V，分離膠用120 V，電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將ECLA和ECLB兩種試劑在離心管中等體積混合，將PVDF膜的蛋白面朝上與此混合液充分接觸，1～2 min 后，去盡殘液，包好，放入暗匣中曝光，最后用顯影、定影試劑進(jìn)行顯影和定影。將顯色后的膜或底片照相，并用Lab Works軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 刺血不同穴位后血清PRL水平比較

空白對(duì)照組C不孕鼠的泌乳素水平最高，孕鼠模型組A各組及模型對(duì)照組B泌乳素水平均有不同程度下降；模型組A各組較模型對(duì)照組B泌乳素水平均有不同程度升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型A 組各組組間比較泌乳素水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；各組泌乳素升高水平皆符合正常孕期的激素水平變化狀態(tài)。表明妊娠期各組大鼠泌乳素水平較處女鼠均有不同程度降低，但不同穴位刺血(少澤穴、至陰穴、少澤至陰穴)均可促進(jìn)妊娠大鼠泌乳素的分泌。詳見(jiàn)表1。

表1 不同穴位刺激大鼠血清中PRL含量

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

3.2 刺血不同穴位后乳腺形態(tài)學(xué)變化比較

空白對(duì)照組C大鼠乳腺小葉腺泡數(shù)少、大小不一，腺泡切面相對(duì)較?。荒Ｐ徒M乳腺小葉腺泡數(shù)量增多，腺泡較為規(guī)則，腺泡切面相對(duì)較大，且模型A組各組較模型對(duì)照組B腺泡數(shù)量增多，腺泡更為規(guī)則；模型組A組組間無(wú)明顯差異。表明妊娠大鼠的乳腺發(fā)育較處女鼠成熟，且不同穴位刺血均可促進(jìn)乳腺小葉腺泡數(shù)量增長(zhǎng)、成熟。詳見(jiàn)圖1。

圖1 不同穴位刺激大鼠乳腺的形態(tài)學(xué)變化

3.3 刺血不同穴位后子宮組織Cx-43蛋白表達(dá)

模型A2組的Cx-43蛋白量及條帶灰度值最高，模型A1組、A3組與模型對(duì)照組B的Cx-43蛋白表達(dá)相比均具有不同程度的升高(P<0.05)，空白對(duì)照組C最低。表明少澤穴、至陰穴對(duì)孕鼠子宮組織Cx-43蛋白的表達(dá)均具有相關(guān)性，且至陰穴的影響具有顯著性。見(jiàn)表2、圖2～3。

表2 不同穴位刺激大鼠子宮組織Cx-43蛋白表達(dá)灰度值

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05。

圖2 不同穴位刺激大鼠條帶灰度值

圖3 不同穴位刺激大鼠目的條帶灰度值和內(nèi)參條帶灰度值比值

4 討論

十二經(jīng)脈的名稱采用三陰三陽(yáng)命名法，手、足經(jīng)脈各有太陽(yáng)、陽(yáng)明、少陽(yáng)、太陰、厥陰、少陰，正因此經(jīng)脈之間的聯(lián)絡(luò)、手足同名經(jīng)腧穴的配伍可有效提高臨床療效[4]。古代文獻(xiàn)中有較多的少澤穴和至陰穴對(duì)孕產(chǎn)婦應(yīng)用的文獻(xiàn)記載，例如《針灸大成》云：“無(wú)乳，膻中、少澤此二穴神效。”《羅遺篇》中記載:“治橫逆難產(chǎn)……如神,蓋此至陰穴也”。兩者所處部位相似，部位的形態(tài)也相似，功能皆指向女性孕產(chǎn)疾患，少澤和至陰之間可能存在功能交互影響，但在現(xiàn)代文獻(xiàn)中未見(jiàn)關(guān)于少澤、至陰交互關(guān)系的研究。

本研究從泌乳素的水平及乳腺形態(tài)變化兩方面證明了刺血少澤、至陰穴的顯著影響及其相關(guān)性，首次在形態(tài)學(xué)視野下，遵循傳統(tǒng)同名經(jīng)配穴法找到了同名經(jīng)、部位對(duì)稱、形態(tài)相似、功效相近、療效確切穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)腧穴——少澤和至陰為研究對(duì)象，通過(guò)系統(tǒng)觀察其對(duì)相關(guān)內(nèi)分泌激素、組織形態(tài)等方面的影響差異，探討同名經(jīng)“同氣相通”理論的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)，既遵守了同名經(jīng)配穴法的中醫(yī)學(xué)術(shù)思想，又因以部位形態(tài)學(xué)相似的腧穴為觀察點(diǎn)則又符合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)重形體的思維方式，即將同名經(jīng)、腧穴、腧穴功能(均指向女性內(nèi)分泌激素)與腧穴部位結(jié)合在一起進(jìn)行研究形成了中西并重的研究特色，提高經(jīng)典理論的現(xiàn)代認(rèn)同性，也能為臨床提供一套穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性高的配穴思路，并且能為進(jìn)一步找到少澤、至陰局部與女性內(nèi)分泌激素關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵因素，賦予傳統(tǒng)腧穴以部位形態(tài)學(xué)等現(xiàn)代意義的研究打下理論和實(shí)踐的基礎(chǔ)。

1933年從動(dòng)物垂體中分離提純得到泌乳素(Prolactin，PRL)[5]，在哺乳動(dòng)物，泌乳素可以促進(jìn)乳腺發(fā)育、發(fā)動(dòng)并維持泌乳[6-7]，PRL常被作為反映乳汁分泌的敏感指標(biāo)之一。在妊娠期，雌激素、孕激素會(huì)抑制泌乳素，但分娩后，雌激素、孕激素降低，泌乳素促進(jìn)泌乳[8]，江青東[9]通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得大鼠PRL的含量在處女期、妊娠前期、妊娠、分娩后呈現(xiàn)“N”形分泌的規(guī)律，符合生理學(xué)的研究。哺乳動(dòng)物的乳腺發(fā)育隨著其受精、妊娠、產(chǎn)仔、哺乳和斷奶的過(guò)程, 可重復(fù)經(jīng)歷妊娠期、泌乳期和退化期[10]。乳腺組織形態(tài)變化可有效反映不同穴位刺激的有效性和相關(guān)性?？p隙連接蛋白43(CX43)是細(xì)胞縫隙連接的主要蛋白，參與細(xì)胞增殖、分化及胚胎發(fā)育過(guò)程的調(diào)節(jié)，對(duì)子宮組織的表達(dá)具有特異性[11]。研究表明，Cx43可促進(jìn)小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞發(fā)生蛻膜化，而子宮內(nèi)膜蛻膜化是胚泡植入、胎盤(pán)形成以及妊娠維持的必備條件之一[12]。本研究從上述指標(biāo)觀察刺血少澤、至陰穴對(duì)孕鼠的不同影響，探究同名經(jīng)“同氣相通”理論的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)依據(jù)。

古人為尋求對(duì)人體的把握而采取將研究對(duì)象按照一定方式進(jìn)行歸類，在處理類與類之間關(guān)系時(shí)，實(shí)現(xiàn)對(duì)事物更深刻的認(rèn)識(shí)和運(yùn)用[13]，故在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)當(dāng)中常有雖為相同的醫(yī)學(xué)名詞，但由于所要認(rèn)識(shí)的對(duì)象不同而采取的分類方式也就不同，該醫(yī)學(xué)名詞的內(nèi)涵也就隨之不同的情況，比如“三焦”“四關(guān)”[14-17]，這也包括對(duì)經(jīng)絡(luò)和腧穴的處理。臟腑官竅之間的功能關(guān)聯(lián)與其之間的形態(tài)學(xué)上的相似性有關(guān)，即“竅法藏”，比如“口”的形態(tài)與“脾”的形態(tài)相似[16]，這為溝通重“神氣”的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與重“形體”的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)提供了橋梁，同名經(jīng)即存在著所處部位以及所處部位的形態(tài)學(xué)上的這類關(guān)聯(lián)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為“同氣相通”理論的科學(xué)實(shí)在性提供了突破口，陳曉楠[18]等通過(guò)文獻(xiàn)與臨床研究加以佐證。

同時(shí)本實(shí)驗(yàn)尚有不足，如模型孕鼠因處于懷孕的特殊時(shí)期，實(shí)驗(yàn)時(shí)每日抓取可引起孕鼠的情緒不穩(wěn)，且劇烈運(yùn)動(dòng)、創(chuàng)傷、手術(shù)等均能增加泌乳素的分泌[19]。這些模型制造中的干擾因素需要進(jìn)一步解決。