表皮松解性掌跖角化病二家系基因突變檢測(cè)

郭韞懿 祝 英 張丹露 郭碧蓉 孫忠輝

表皮松解性掌跖角皮癥(epidermolytic palmoplantar keratoderma，EPPK)主要臨床表現(xiàn)是手掌和足趾發(fā)生過(guò)度角化，是一種常染色體顯性遺傳病[1]。目前研究顯示該病是由不同致病基因引起：KRT1、KRT9和KRTl6，因此該病具有遺傳異質(zhì)性。本課題組診斷兩個(gè)表皮松解性掌跖角化癥家系，進(jìn)行了致病基因研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 先證者1，男，58歲，工人。因雙掌跖角化50余年，于2015年8月來(lái)我院就診。先證者自4歲起無(wú)明顯誘因雙掌跖部出現(xiàn)對(duì)稱性片狀紅斑，角化，形狀不規(guī)則，受累皮膚粗糙增厚，一般無(wú)自覺(jué)癥狀，有時(shí)伴有瘙癢、疼痛。皮疹逐漸向周圍擴(kuò)展，至15歲時(shí)已累及雙手整個(gè)掌側(cè)及雙足跖，部分皮疹成蠟黃色角化性斑塊；指(趾)甲未見增厚、混濁。23歲后皮疹未再擴(kuò)展。期間雙掌、雙足部皮疹反復(fù)發(fā)作，有一定季節(jié)性，冬重夏輕，伴有足部多汗(圖1a、1b)。家族史：調(diào)查家族中4代人。先證者父母非近親結(jié)婚，外祖父、母親(均已亡)有此病史，先證者兒子正常。符合常染色體顯性遺傳模式。體格檢查：一般情況良好，各系統(tǒng)檢查未見明顯異常。皮膚科檢查：皮疹分布于雙手掌、雙足底部，主要表現(xiàn)為境界清楚的黃色角化斑塊、丘疹，伴脫屑。

先證者2，男，37歲，工人。因雙掌跖角化30余年，于2015年6月來(lái)我院就診。先證者自5歲起無(wú)明顯誘因雙掌跖部出現(xiàn)對(duì)稱性片狀紅斑，角化，形狀不規(guī)則，受累皮膚粗糙增厚，通常無(wú)自覺(jué)癥狀，有時(shí)伴有瘙癢、疼痛。皮疹逐漸向周圍擴(kuò)展，至20歲時(shí)已累及雙手整個(gè)掌側(cè)和雙足跖，部分皮疹成堅(jiān)硬蠟黃色角化斑塊；指(趾)甲未見變形。20歲后皮疹未再擴(kuò)展。期間雙掌，雙足部皮疹反復(fù)發(fā)作，呈角化過(guò)度，脫落，再角化，交替進(jìn)行，有一定季節(jié)性，冬重夏輕。(圖1c、1d)。家族史：調(diào)查家族中3代人。先證者父母非近親結(jié)婚，父親發(fā)病(已亡)；目前家族中共有患者3人，其中男2例，女1例。先證者兒子、女兒發(fā)病，符合常染色體顯性遺傳模式。體格檢查：一般情況良好，各系統(tǒng)檢查未見明顯異常。皮膚科檢查：皮疹分布于雙手掌、雙足底部，主要表現(xiàn)為境界清楚的黃色角化斑塊、有皸裂。

兩例先證者病理相似：角化亢進(jìn)，表皮增生，顆粒層增厚，棘層肥厚，真皮淺層血管周圍稀疏淋巴組織細(xì)胞浸潤(rùn)。顆粒層及棘層未見裂隙及顆粒性空泡變性，未見表皮松解(圖1e、1f)。

1.2 外周血DNA提取 獲得知情并簽署同意書后，抽取2家系患者及親屬外周血3mL。其中，家系2患者為先證者2和一子、一女。應(yīng)用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德國(guó))提取基因組DNA，標(biāo)化質(zhì)量濃度至10mg/μ。另外，以同樣的方法提取100名無(wú)親緣關(guān)系的健康個(gè)體基因組DNA作為對(duì)照。

1.3 PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序 通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查取KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列,Primer 3.0設(shè)計(jì)KRT1、KRT9和KRT16外顯子特異性引物 (htttp://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)。PCR擴(kuò)增后，所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后直接在ABI PRISM? 3700測(cè)序儀上測(cè)序(Applied Biosystems)。測(cè)序結(jié)果與人類基因組KRT1、KRT9和KRT16基因核苷酸序列比較。使用Chromas 2.2軟件進(jìn)行解讀，并用Geneious 11.1進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)：患者1家系先證者KRT1基因CDS第598處雜合T堿基成為C堿基，因此編碼的苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼帷＜矗篶.598T>C，p.F200L。經(jīng)檢索HGMD(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)、LOVD(http://www.lovd.nl/3.0/home)數(shù)據(jù)庫(kù)該突變是國(guó)內(nèi)首次報(bào)道(圖2a)。家系2先證者及子女 KRT9基因CDS第488處雜合T堿基成為A堿基，因此編碼的精氨酸變?yōu)樘於０?。即：c.G488>A,p.R163Q。該突變?yōu)樵摬〕Ｒ娡蛔?圖2b)。而兩個(gè)家系的家系內(nèi)正常對(duì)照及家系外100個(gè)無(wú)親緣關(guān)系的正常人中均不存在此突變。

圖11a、1b：先證者1臨床表現(xiàn)；1c、1d：先證者2臨床表現(xiàn)；1e、1f：先證者1組織病理可見角化亢進(jìn)，表皮增生，顆粒層增厚，棘層肥厚，真皮淺層血管周圍稀疏淋巴組織細(xì)胞浸潤(rùn)(HE，×40；×200)

2a、2b：家系1和家系2家系圖；2c、2d：家系1、家系2患者測(cè)序結(jié)果

圖2家系圖和測(cè)序結(jié)果 (箭頭所示為先證者，+表示DNA測(cè)序者)

3 討論

掌跖角皮癥(palmoplantar keratoderma，PPK)是一組掌跖角化疾病的統(tǒng)稱，存在二十幾種亞型。根據(jù)臨床癥狀發(fā)生形態(tài)的不同，PPK可以分為3種類型：彌漫性、局灶性和點(diǎn)狀性。由于是僅根據(jù)臨床形態(tài)來(lái)分型，而每一型往往致病基因有多個(gè)，所以總的來(lái)說(shuō)PPK是遺傳異質(zhì)性很強(qiáng)的一組疾病。EPPK是彌漫性掌跖角皮癥的一個(gè)亞型，OMIM號(hào)為144200。根據(jù)國(guó)際人類中間絲數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Intermediate Filament Database，HIFD,http://www.interfil.org/)截止2014年11月22日的數(shù)據(jù)顯示，目前明確的致病基因有KRT1、KRT9 和KRT16。我們雖將KRT16基因列入侯測(cè)基因，但既往僅報(bào)道過(guò)一例EPPK是KRT16突變引起，也僅是罕見的嵌合型[2]，目前的文獻(xiàn)表明所有KRT16基因突變與先天性厚甲癥[3]有關(guān)。因此EPPK主要致病基因是KRT1和KRT9。

EPPK屬于常染色體顯性遺傳，多為嬰兒期開始發(fā)病，輕者僅有掌跖皮膚粗糙，重者掌跖處出現(xiàn)表皮松解性斑塊狀、邊緣清晰的角質(zhì)增厚，呈黃色胼胝體樣。有時(shí)角質(zhì)增厚可蔓延至掌跖皮膚側(cè)緣或手足背，可伴有指節(jié)墊、甲板增厚渾濁、指趾屈曲畸形等。病理：表皮高度角化過(guò)度，顆粒層及棘層增厚；可有表皮松解，即可見裂隙及顆粒性空泡變性。EPPK與非表皮松解性掌跖角皮癥(NEPPK)本質(zhì)是同一病，因臨床改變是一樣的，且都是KRT1、KRT9突變引起。NEPPK 又名“Thost” 型掌跖角皮癥，早在1880年由Thost 發(fā)現(xiàn)并命名。2002年Kuster等[4]重新檢測(cè)了Thost患者的后裔，結(jié)果組織病理還是顯示有表皮松解。本研究致病突變檢測(cè)，家系1先證者的KRT1基因突變p.F200L 2016年Gagliardi[5]已報(bào)道；而家系2的KRT9基因突變p.R163Q是目前國(guó)內(nèi)外均已報(bào)道的熱點(diǎn)突變。雖然兩先證者組織病理都未見表皮松解現(xiàn)象，但結(jié)合臨床癥狀和基因診斷結(jié)果，兩家系患者都診斷為EPPK。

KRT9角蛋白局限性的表達(dá)于掌跖表皮中[6]，突變引起的疾病僅是EPPK 。KRT9基因雖然異質(zhì)性不強(qiáng)，但存在突變熱點(diǎn)區(qū)和熱點(diǎn)突變。數(shù)據(jù)庫(kù)顯示KRT9基因突變熱點(diǎn)區(qū)位于1A區(qū)前端的157-172個(gè)氨基酸位置。在總共25個(gè)突變中位于1A區(qū)域有20個(gè)，位于2B區(qū)僅5個(gè)?；蛲蛔冾l率最高的是第163氨基酸突變，Liu[7]統(tǒng)計(jì)該位置約占所有報(bào)道病例的44%，而p.R163W約占29.33%,其次為p.R163Q約占10%。第163位氨基酸突變可能影響角蛋白中間絲組裝，從而導(dǎo)致EPPK。本研究先證者2家系正是攜帶此突變，因而是明確的EPPK。

相較于KRT9角蛋白，KRT1角蛋白主要表達(dá)在全身表皮的棘層和顆粒層細(xì)胞,其突變可以引起眾多表型。目前顯示除了EPPK，表皮松解性角化過(guò)度型魚鱗病(EHK)、先天性大皰性魚鱗病樣紅皮病(BCIE)、周期性魚鱗病伴表皮松解性角化過(guò)度(CIEH)、豪豬狀魚鱗病(IHCM)、彌漫性非表皮松解性掌跖角皮癥(NEPPK)、條紋狀掌跖角皮癥(SPPK)、常染色體顯性遺傳腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(ADLD)和 Greither綜合征(GS)也與其突變有關(guān)。HIFD數(shù)據(jù)庫(kù)顯示KRT1突變目前有47個(gè)，大多數(shù)(32個(gè))是引起表型相對(duì)嚴(yán)重的BCIE,而表型相對(duì)較輕的PPK(包括EPPK,NEPPK)僅有8個(gè)，均為錯(cuò)義突變。引起B(yǎng)CIE的突變絕大多數(shù)位于角蛋白1A和2B區(qū)域。KRT1中1A和2B是編碼體內(nèi)角蛋白絲裝配的重要區(qū)域，該區(qū)域改變會(huì)影響角蛋白絲的形成并影響其穩(wěn)定性，進(jìn)而影響角蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成[8]。在8個(gè)引起PPK的突變中，影響的編碼序列分別位于頭、1A、1B和2B區(qū)域，未顯示突變熱點(diǎn)。PPK有遺傳異質(zhì)性，同樣在KRT1基因也表現(xiàn)出了復(fù)雜的臨床異質(zhì)性。KRT1同一突變可在家系內(nèi)引起不同表型，比如Nellen[9]描述一家系攜帶c.1016T>A，4歲先證者是嚴(yán)重的表皮松解EHK。患者不僅有EPPK和屈曲部位的疣狀增厚，還有軀干部位過(guò)度角化和去除鱗屑后的糜爛。而患者家系其他患者僅有EPPK和皮膚摩擦后出現(xiàn)水皰。同樣的，KRT1同一突變可在家系以外引起不同表型。比如國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道的一例EPPK[10]與國(guó)外報(bào)道[11]的BCIE和CIEH的致病突變都是KRT1錯(cuò)義突變c.1436T>C。

然而，本研究先證者1的突變p.P200L目前文獻(xiàn)顯示僅一例為意大利報(bào)道[5]。Gagliardi報(bào)道采用外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)一家系中既有進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮綜合征(CMT)，又有PPK的患者4例，其他患者單獨(dú)患有CMT或PPK各1例。作者認(rèn)為這兩個(gè)疾病是單獨(dú)引起，致病突變分別是MPZ 基因的p.Ser44Phe 和KRTI基因p.P200L。p.P200L位于1A區(qū)域，經(jīng)蛋白預(yù)測(cè)軟件SIFT Pred、Polyphen 2和 Mutation Taster都認(rèn)為是致病突變。由于其合并其它基因突變、表型復(fù)雜，p.P200L所致EPPK的病情是否發(fā)展、有無(wú)異質(zhì)性，還需隨訪觀察。我們報(bào)道的也是同一突變PPK家系，符合文獻(xiàn)，但無(wú)其它合并基因突變疾病。由于KRT1基因突變存在上文所述的復(fù)雜的臨床異質(zhì)性，所以先證者1還是需要隨訪，以觀察其病情發(fā)展。另外，本突變?cè)谥袊?guó)人群是首例報(bào)道。