高溫對韭菜根際微生物多樣性的影響

周仙紅　王琰　范曉杰　高歡歡　覃冬云　莊乾營　于毅

摘要：為明確高溫對韭菜根際微生物多樣性的影響，本研究通過對高溫處理的韭菜根部及根際土壤中的微生物進(jìn)行分離純化，并對分離得到的真菌和細(xì)菌分別采用ITS和16S rDNA基因分析方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，未分離出真菌，分離鑒定出20種細(xì)菌。其中，在無韭蛆組的韭菜根部和根際土壤中分別分離出14、12種細(xì)菌，有韭蛆組的韭菜根部和土壤中分別分離出14、13種細(xì)菌，以變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌為主，其余的細(xì)菌屬于放線菌門（Actinobacteria）。溫度越高，厚壁菌門及放線菌門細(xì)菌出現(xiàn)頻率越高;高溫處理（35～50℃）的韭菜根部和根際土壤中細(xì)菌種類均少于其對照組。

關(guān)鍵詞：韭蛆;韭菜;高溫;根際微生物;多樣性

中圖分類號：S477+.1文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）11-0081-06

Effects of High Temperature on Rhizosphere

Microbial Diversity of Chives

Zhou Xianhong1， Wang Yan2， Fan Xiaojie1， Gao Huanhuan3， Qin Dongyun1， Zhuang Qianying1， Yu Yi1

（1. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Key Laboratory for Plant Virology of Shandong Province， Jinan 250100， China;

2. Agricultural Comprehensive Law Enforcement Unit of Rushan City， Rushan 264500， China;

3. Shandong Institute of Grape， Jinan 250100， China）

Abstract To understand the effect of high temperature on the diversity of rhizosphere microorganisms of chives， the microorganisms from the roots （partial bulbs and nearby roots） and soils under high temperature treatment were separated， purified and identified through ITS and 16S rDNA genetic analysis. The results showed that no fungi were isolated and 20 kinds of bacteria were identified. Fourteen and twelve bacterial species were identified from the chive roots and soils in no Bradysia odoriphaga group respectively，and 14 and 13 bacterial species were identified from the chive roots and soils in group with B. odoriphaga， respectively. Most bacterial species belonged to the Proteobacteria and Firmicutes， the rest belonged to Actinobacteria. The bacteria of Firmicutes and Actinobacteria were discovered at higher temperatures. The bacterial species from the chive roots and soils at high temperatures （35～50℃） were less than those of the control group.

Keywords Bradysia odoriphaga; Chives; High temperature; Rhizosphere microorganism; Diversity

韭菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang）屬雙翅目長角亞目眼蕈蚊科遲眼蕈蚊屬，是韭菜、蔥、蒜等蔬菜的重要害蟲，俗稱韭蛆[1， 2]。韭蛆幼蟲群集蛀食韭菜根部、假莖和鱗莖使其腐爛，腐爛部位會出現(xiàn)大量微生物，韭蛆在微生物富集的環(huán)境中可以大量生存繁殖，這說明在韭蛆、韭菜以及微生物之間存在密不可分的關(guān)系[3]。

植物根際微生物主要分為抑制植物生長的有害微生物和促進(jìn)植物生長的有益微生物[4]，其多樣性受自然因素、人為因素等多種因素的影響。其中自然因素包括土壤質(zhì)地、土壤溫度、土壤水分含量、土壤pH值、有機(jī)質(zhì)和礦物質(zhì)含量等;人為因素主要為農(nóng)業(yè)耕作方式、種植制度、農(nóng)業(yè)植被類型、田間管理等。由于人類農(nóng)業(yè)活動對土壤的物理化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響從而影響土壤中微生物的多樣性[5-7]。微生物與宿主植物及昆蟲之間存在的也不僅僅是致病關(guān)系，還包括互利的非致病關(guān)系。微生物可以通過產(chǎn)生激素類物質(zhì)、促進(jìn)植物養(yǎng)分吸收、誘導(dǎo)植株增強(qiáng)抗性等直接作用方式、抑制病原菌生長的間接作用方式促進(jìn)植物生長[8]。有些微生物是昆蟲生長發(fā)育、繁殖所必需的。昆蟲的取食作用可對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響，如細(xì)菌真菌比、細(xì)菌群落中革蘭氏陽性菌和陰性菌的相對比例以及菌根真菌的群落結(jié)構(gòu)等[9]。有研究表明蚜蟲低強(qiáng)度的取食作用可以誘導(dǎo)水稻根系土壤微生物的生物量[10]，兩種飛蛾幼蟲（Operophtera brumata， Epirrita autumnata）對樹木葉片的爆發(fā)性取食會導(dǎo)致土壤微生物群落中的細(xì)菌數(shù)量顯著上升[11]。

地表覆膜法防治韭蛆效果很好，其技術(shù)要求土壤溫度達(dá)到39℃以上，此時對韭菜生長無影響[12，13]，但對韭菜根部和根際土壤微生物多樣性是否有影響尚不清楚。本研究通過室內(nèi)試驗，利用ITS和16S rDNA基因分析方法研究高溫對韭菜根際微生物多樣性的影響，為更好地應(yīng)用高溫覆膜防治韭蛆提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試韭菜：三年生獨根紅，采自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，割去地上部后挖根帶土單株移栽至花盆（Φ=10 cm）中。

供試?yán)ハx：韭菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang）采自山東省壽光市韭菜田，于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所養(yǎng)蟲室內(nèi)用人工飼料[14]連續(xù)飼養(yǎng)多代，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、相對濕度（70±5）%。選用健康的3齡幼蟲為試驗用蟲。

1.2 試驗儀器與試劑

超凈工作臺（SW-Cj-ZFD，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-1ES，北京市永光明醫(yī)療儀器廠），人工氣候培養(yǎng)箱（RXZ-328A型，寧波江南儀器廠），離心機(jī)（D-78532，德國Tuttlingen），PCR儀（EPS301，美國Pharmacia），電泳儀（JY3000，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（JY04S-3C，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。NB培養(yǎng)基，孟加拉紅培養(yǎng)基，PBS 緩沖液，DNA 提取試劑盒DV811A（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，天根生化科技有限公司），2×Taq PlusPCR Master Mix（天根生化科技有限公司），土豆，葡萄糖，瓊脂粉，一次性培養(yǎng)皿，16S rDNA和ITS引物。

1.3 試驗前期處理

試驗分為5組：35℃、40℃、45℃、50℃及CK處理（室溫），每種溫度條件下分別設(shè)置有韭蛆處理組（每盆接入20頭3齡幼蟲）和無韭蛆處理組。將有韭蛆和無韭蛆的單盆韭菜分別用60目防蟲網(wǎng)罩罩上，20 d后在不同溫度下處理4 h，每個處理重復(fù)3盆。

1.4 微生物的分離純化及鑒定

1.4.1 微生物的分離純化

選取韭菜根部（包括鱗莖及附近根，以下均用根部表示）和根際土壤分別用無菌 PBS 緩沖液浸泡。吸取浸泡液分別用無菌水稀釋106、107、108、109倍，制備不同濃度的菌懸液。分別吸取200 μL涂布于NB板、PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，每個濃度3個重復(fù)。涂板后放置25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在單菌落明顯的NB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中統(tǒng)計單菌落個數(shù)，根據(jù)稀釋濃度計算不同處理菌懸液中細(xì)菌和真菌的數(shù)量。

選擇PDA培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基平板中的真菌，挑取菌落在新的PDA平板中純化3次。純化好的真菌保存到PDA培養(yǎng)基斜面上，放置在 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

選擇細(xì)菌單菌落進(jìn)行劃線純化，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落出現(xiàn)后，連續(xù)劃線培養(yǎng)4～5次，挑取純化好的菌落進(jìn)行編號，在NB液體培養(yǎng)基中過夜搖菌，加等體積60%的甘油于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 微生物的鑒定

（1）細(xì)菌的鑒定：采用16S rDNA鑒定法。提取分離純化后的細(xì)菌 DNA并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，檢測合格后保存于-20℃冰箱備用。PCR反應(yīng)體系為：DNA 模板1 μL，2×Taq Plus PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，加ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94℃ 3 min;94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán);72℃ 5 min。退火時間因細(xì)菌不同而不同。引物序列：16S rDNA-27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;16S rDNA-1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′。

（2）真菌的鑒定：采用 ITS 鑒定法。收集分離純化后的真菌菌絲提取 DNA并進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，DNA 提取方法及PCR反應(yīng)體系同上。PCR 反應(yīng)程序：94℃ 3 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán);72℃ 5 min。引物序列：ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′;ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

（3）測序分析：將PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，其中16S rDNA為雙向測序，ITS為單向測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST分析，以此判斷微生物的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫處理下韭菜根際微生物的分離鑒定

從不同溫度處理的韭菜根部和根際土壤中未分離出真菌，細(xì)菌20種，所得細(xì)菌隸屬于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）。其中包括變形菌門α-變形菌綱的柄桿菌屬（Caulobacter sp.）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas sp.），β-變形菌綱的爭論貪食菌（Variovorax paradoxus）和代爾夫特菌屬（Delftia sp.），γ-變形菌綱的多食鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium multivorum）、無色桿菌屬（Achromobacter sp.）、2種腸桿菌屬（Enterobacter sp.）和3種假單胞桿菌屬（Pseudomonas sp.）細(xì)菌;厚壁菌門芽孢桿菌綱的7種芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）以及放線菌門放線菌綱的2種節(jié)桿菌屬（Arthrobacter sp.）細(xì)菌。

如表1所示，無韭蛆處理組共分離出18種細(xì)菌。根部分離出14種細(xì)菌，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門比例分別為53.4%、33.3%和13.3%。CK組（室溫?zé)o韭蛆組）分離出5種變形菌門、2種厚壁菌門和2種放線菌門共9種細(xì)菌;35℃分離出1種變形菌門和2種厚壁菌門共3種細(xì)菌;40℃分離出3種變形菌門和1種厚壁菌門共4種細(xì)菌;45℃分離出2種變形菌門和1種放線菌門共3種細(xì)菌;50℃分離出2種變形菌門、1種厚壁菌門和2種放線菌門共5種細(xì)菌。土壤中分離出12種細(xì)菌，以變形菌門和厚壁菌門細(xì)菌為主，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門分別占46.2%、38.5%和15.3%。CK組分離出3種變形菌門、2種厚壁菌門和1種放線菌門共6種細(xì)菌;35℃分離出1種變形菌門和3種厚壁菌門共4種細(xì)菌;40℃分離出2種變形菌門、1種厚壁菌門和1種放線菌門共4種細(xì)菌;45℃分離出3種變形菌門、1種厚壁菌門和1種放線菌門共5種細(xì)菌;50℃分離出2種變形菌門、2種厚壁菌門和1種放線菌門共5種細(xì)菌。

表2結(jié)果表明，有韭蛆處理組共分離出16種細(xì)菌。韭菜根部分離出14種細(xì)菌，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門分別占57.1%、28.6%和14.3%。CK組（室溫有韭蛆組）分離出4種變形菌門、1種厚壁菌門和1種放線菌門共6種細(xì)菌;35℃分離出2種變形菌門和2種放線菌門共4種細(xì)菌;40℃分離出3種變形菌門和2種厚壁菌門共5種細(xì)菌;45℃分離出1種變形菌門和2種放線菌門共3種細(xì)菌;50℃分離出3種變形菌門和2種厚壁菌門共5種細(xì)菌。根際土壤中分離出13種細(xì)菌，變形菌門、厚壁菌門和放線菌門分別占53.8%、30.8%和15.4%。CK組分離出3種變形菌門、3種厚壁菌門和1種放線菌門共7種細(xì)菌;35℃分離出1種變形菌門和1種厚壁菌門共2種細(xì)菌;40℃分離出1種變形菌門、1種厚壁菌門和2種放線菌門共4種細(xì)菌;45℃分離出2種變形菌門、2種厚壁菌門和1種放線菌門共5種細(xì)菌;50℃分離出2種變形菌門、2種厚壁菌門和1種放線菌門共5種細(xì)菌。

綜上所述，無韭蛆和有韭蛆高溫處理（35℃～50℃）組的細(xì)菌種類均少于其對照組。變形菌門細(xì)菌為優(yōu)勢菌群，厚壁菌門次之，放線菌門最少。溫度高時厚壁菌門及放線菌門細(xì)菌出現(xiàn)頻率高。

2.2 基因同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過16S rDNA 序列比對發(fā)現(xiàn)，分離出的細(xì)菌與NCBI 核苷酸數(shù)據(jù)庫中序列的同源性均達(dá)到99%以上，其中代爾夫特菌屬 （Delftia sp.）、解淀粉芽孢桿菌 （Bacillus amyloliquefaciens）、食物芽孢桿菌 （Bacillus cibi）、枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis）、短小芽孢桿菌 （Bacillus pumilus）、滋養(yǎng)節(jié)桿菌 （Arthrobacter pascens）和節(jié)桿菌屬 （Arthrobacter sp.）分別與 MF689014.1、DQ422953.1、KU601303.1、JF496331.1、KJ526890.1、KC934790.1和 JN601428.1的序列完全吻合，達(dá)到100%的同源性（圖1）。

3 討論與結(jié)論

本研究對韭菜根部及根際土壤微生物進(jìn)行分離純化，并對分離得到的真菌及細(xì)菌分別采用 ITS 和 16S rDNA 基因分析方法進(jìn)行鑒定，總共分離鑒定出真菌0種、細(xì)菌20種。其中無韭蛆組韭菜根部和根際土壤分別分離出14、12種細(xì)菌，有韭蛆組韭菜分別分離出14、13種細(xì)菌，以變形菌門（Proteobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）細(xì)菌為主，其次為放線菌門（Actinobacteria）。

本研究分離出的多種芽孢桿菌可能對有益于韭蛆生長的細(xì)菌具有抑制作用[3]。有些細(xì)菌在宿主的生理過程中起到重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌（B. Amyloliquefaciens）是一種與枯草芽孢桿菌（B. subtilis）具有很高親緣性并且具有廣泛抑菌譜的細(xì)菌，其菌體及一系列代謝產(chǎn)物可以抑制細(xì)菌以及真菌的生長[15， 16]。郝建安等研究表明，解淀粉芽孢桿菌NK10.BAhjaWT 菌株對茄病鐮刀菌 （Fusarinm solani）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、黑曲霉（Aspergillus niger）等多種真菌都有較好的抑制作用[17]，同時解淀粉芽孢桿菌也是一種纖維素酶產(chǎn)生菌，對于取食韭菜這種纖維素含量較多的植物昆蟲來說可能有助于其消化[3]。假單胞桿菌（Pseudomonas sp.）多定殖于土壤、水和植物根系中，具有抑制植物病原菌、幫助植物吸收營養(yǎng)、促進(jìn)其生長的作用[18];熒光假單胞桿菌（P. fluorescens）能有效保護(hù)植物根系免受病原微生物的侵害，在維持植物根際平衡和防治農(nóng)作物疾病方面起著重要作用[19];惡臭假單胞桿菌（P. putida，Hall Judith）具有谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性，能顯著促進(jìn)植物根的生長[20， 21];多食鞘氨醇菌（S. multivorum）ED菌株對生活污泥具有較好的生物降解作用[22]。

試驗結(jié)果表明有韭蛆組細(xì)菌數(shù)量較無韭蛆組數(shù)量少，可能是由于韭蛆取食韭菜導(dǎo)致。有研究證明昆蟲的取食強(qiáng)度、持續(xù)時間等會對根際土壤微生物產(chǎn)生影響，如蚜蟲低強(qiáng)度的取食作用可以誘導(dǎo)水稻根系生物量明顯增加，從而增加土壤微生物的生物量，但高強(qiáng)度的取食作用會導(dǎo)致水稻根系生物量顯著減少而抑制根際微生物的活動[10]。厚壁菌門的芽孢桿菌（Bacillus sp.）對高溫有較強(qiáng)的耐受性，例如枯草芽孢桿菌90℃處理10 min后死亡率為12%左右[23];車敏娜等研究證明放線菌門細(xì)菌具有較強(qiáng)的耐熱性，有些放線菌生長溫度范圍在50～65℃[24]，與本試驗中溫度高時厚壁菌門及放線菌門細(xì)菌出現(xiàn)頻率高一致。本試驗高溫處理后細(xì)菌種類少于對照組，可能是試驗設(shè)置的溫度超過了有些細(xì)菌的生長溫度，從而導(dǎo)致細(xì)菌種類減少。宋健等的田間調(diào)查研究也表明高溫覆膜0 d土壤微生物的豐富度指數(shù)低于對照但無顯著差異[13]。本試驗采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法探明了高溫下根際微生物的適應(yīng)能力，可為田間覆膜技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)有效的理論依據(jù)。

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收稿日期：2019-06-25

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018E04，CXGC2016B11）;國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFD0201207）

作者簡介：周仙紅（1982—），女，博士，主要研究方向為害蟲綜合防治。E-mail：zhouxianhong82@163.com

通訊作者：于毅（1965—），男，研究員，主要研究方向為害蟲綜合防治。E-mail：robertyuyi@163.com