孔雀草花水提物對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護作用

羅思敏，蔡德成，康廷國*，竇德強*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600；2.大連五州神草健康科技有限公司，遼寧 大連 116600)

孔雀草(TagetespatulaL.)是菊科萬壽菊屬一年生草本植物，又稱紅黃草、小萬壽菊、臭芙蓉。其花色多樣，顏色鮮艷，有黃色、橘色、紅黃相間等，花瓣又分單瓣、重瓣，在國內(nèi)作為經(jīng)濟美觀的觀賞性植物多用于園林栽培，香氣四溢，可作芳香劑。孔雀草原產(chǎn)墨西哥，現(xiàn)多分布于四川、貴州、云南等地。文獻記載，孔雀草具有清熱利濕、止咳、止痛的功效，用于上呼吸道感染、痢疾、咳嗽、百日咳、牙痛、風(fēng)火眼痛的治療，外用治療腮腺炎、乳腺炎[1]。國外學(xué)者研究孔雀草具有抗氧化、抗菌、抗炎、治療心血管疾病等藥理活性，俄羅斯高加索地區(qū)居民常食用孔雀草，有延年益壽之效。另有國外文獻報道，孔雀草花可治療高脂血癥引起的肝損傷和抗脂質(zhì)過氧化[2]。本課題組通過早期研究發(fā)現(xiàn)孔雀草有治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎的作用[3]，并在孔雀草中分離出黃酮及其苷類、葉黃素、噻吩類、甾醇以及揮發(fā)油等化學(xué)成分[4]。近年來中草藥治療肝病潛力巨大，前景廣闊，皂苷類、多糖、黃酮類等成分在治療肝臟疾病中具有顯著的療效[5]，從中草藥中研究和開發(fā)是尋找新藥的突破口，也是現(xiàn)代藥學(xué)研究的發(fā)展方向。孔雀草常用藥用部位為全草，孔雀草花卻極少作為藥用。本研究旨在探索孔雀草花對CCl4致小鼠極性肝損傷的保護作用，觀察不同濃度的提取液對肝損傷小鼠的影響，為孔雀草的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

ICR小鼠50只，雄性，體質(zhì)量20～22 g，6～8周齡，由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供(許可證號：SCXK(遼)2015-0001)，置于室溫(22±1)℃，相對濕度65%及正常晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)光照時間環(huán)境下，食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.2 藥物

孔雀草花于2017年6月20日采自遼寧省大連市金州開發(fā)區(qū)，由大連五舟神草健康科技有限公司提供，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院王冰教授鑒定為菊科萬壽菊屬孔雀草TagetespatulaL.的干燥花。四氯化碳(天津大茂化學(xué)試劑廠，批號20171201)使用時用葵花籽油配制成0.5%的葵花籽油溶液。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(批號：180525)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)(批號：180525)、丙二醛(MDA)(批號：180525)、超氧化物歧化酶(SOD)(批號：180525)試劑盒均購于上海優(yōu)選生物科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

TDZ4-WS低速臺式離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；UV-2100 紫外分光光度計(上海UNICO公司)；FA-1004電子天平(上海精科天平廠)；KC-100型酶標(biāo)分析儀(深圳凱特生物醫(yī)療電子科技有限)；BX51光學(xué)顯微鏡(日本O-LYMPUS公司)。

1.4 孔雀草花水提物制備

孔雀草干花用剪刀剪碎后用打粉機粉碎，稱取藥材粉末，加10倍量水浸泡過夜，加熱回流提取1 h，濾布過濾；再加8倍量水加熱回流提取1 h，濾布過濾，合并兩次濾液，濃縮得到孔雀草花水提物，放至4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 動物分組給藥及建模

50只小鼠按體重隨機分為5組，每組10只，分別為空白對照組，模型組，孔雀草花低、中、高劑量組(對應(yīng)生藥量為1.126 g/kg、2.252 g/kg、4.504 g/kg)。各給藥組均給予相應(yīng)藥物，空白組與模型組給同體積蒸餾水，給藥體積0.4 mL/20 g，連續(xù)灌胃10 d。末次灌胃2 h后，除空白組腹腔注射葵花籽油溶液外，其余各組均腹腔注射給予四氯化碳葵花籽油溶液(0.5%)，造模劑量為10 mL/kg，隨后禁食不禁水[6]。24 h后摘取小鼠眼球取血，分離血清，頸椎脫臼處死小鼠并取肝臟。

1.6 檢測指標(biāo)

生化法測定血清中AST、ALT含量。

取肝臟左小葉約0.4 g，生理鹽水沖洗后，組織勻漿，4 000 r/min離心5 min。取上清液備用，采用酶聯(lián)免疫法測定肝臟組織中SOD、MAD含量。

1.7 肝臟病理觀察

摘取肝右葉，置于4%的多聚甲醛溶液中固定48 h，石蠟包埋切片，常規(guī)Hema-toxy-Eosin(HE)染色，光鏡下觀察肝臟組織病理改變。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 對血清中ALT、AST活力影響

結(jié)果如表1所示，模型組小鼠血清中ALT、AST含量與空白組相比明顯升高(P<0.01)，表明造模成功。而與模型組比較，中劑量組小鼠ALT活力降低(P<0.05)，血清AST活力明顯下降(P<0.01)。高劑量水煎液對小鼠血清中ALT、AST活力有顯著的抑制作用(P<0.01)。隨著孔雀草花水提物給藥濃度的增大，ALT、AST活力逐漸降低。

組別ALT(U/L)AST(U/L)空白對照組7.97±3.41**11.02±4.63**模型組23.46±6.06##33.07±9.37##孔雀草花低劑量組20.36±5.71##28.77±9.09##*孔雀草花中劑量組18.46±5.41##25.40±6.35##**孔雀草花高劑量組10.00±3.67**17.91±5.99#**

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 對肝組織中MDA含量與SOD活性的影響

結(jié)果如表2所示，模型組小鼠肝臟MDA含量與空白組相比明顯升高，模型組小鼠SOD活力與空白組相比明顯降低，表明造模成功。與模型組相比，低劑量組小鼠MDA含量明顯降低(P<0.05)，SOD明顯升高(P<0.05)。中劑量組和高劑量組小鼠MDA含量明顯下降(P<0.01)，SOD活力顯著上升(P<0.01)。提示孔雀草花有很強的抗氧化作用。

組別MDA(nmol/g)SOD(U/g)空白對照組29.16±8.01**2506.36±305.52**模型組39.26±8.51##1917.63±185.06##孔雀草花低劑量組32.05±7.56*2344.54±273.53*孔雀草花中劑量組30.59±4.25**2480.80±680.92**孔雀草花高劑量組29.03±5.31**2778.22±503.13**

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 對肝組織中IL-6、TNF-α含量的影響

結(jié)果如表3所示，模型組小鼠肝臟中TNF-α，IL-6含量與空白組相比明顯升高，表明造模成功。與模型組相比，低劑量組小鼠IL-6水平明顯降低(P<0.01)，中劑量組小鼠IL-6(P<0.01)、TNF-α(P<0.05)水平明顯降低。高劑量組小鼠IL-6、TNF-α表達均有顯著下降(P<0.01)?？梢娧装Y因子與劑量呈依賴關(guān)系。

組別IL-6(pg/ml)TNF-α(pg/ml)空白組36.50±8.79**27.16±9.08*模型組47.33±6.02##35.36±8.48#孔雀草花低劑量組32.52±6.34**28.97±9.67孔雀草花中劑量組34.29±11.59**27.16±5.09*孔雀草花高劑量組36.65±12.12**22.73±9.59**

注：與空白對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

2.4 孔雀草花對小鼠肝組織病理學(xué)的影響

肉眼可見，正常對照組小鼠肝臟呈鮮紅色，富有彈性，且表面光滑；模型組小鼠肝臟表面有大量顆粒狀并帶有黃褐色；孔雀草給藥組小鼠肝臟顏色較正常對照組顏色稍淺，表面顆粒狀較少，略有粗糙質(zhì)感，損傷明顯減輕。鏡下觀察，正常對照組小鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝血竇排列規(guī)則，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組可見肝小葉中肝細(xì)胞大小不等，有大片灶狀壞死，細(xì)胞空泡，中央靜脈周圍有較多炎性細(xì)胞浸潤，與對照組比較有明顯差異，說明制備CCl4肝損傷模型成功。低劑量組小鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)有恢復(fù)，界線基本清晰；中、高劑量組小鼠肝細(xì)胞水腫，壞死程度不同程度減輕，細(xì)胞索排列較有序，肝組織炎癥改善并伴有少量肝細(xì)胞再生；中、高劑量孔雀草花對CCl4致急性肝損傷均有明顯保護作用。

(A)空白組；(B)模型組；(C)低劑量組；(D)中劑量組；(E)高劑量組

3 討論

綜上所述，孔雀草花能減輕CCl4所致的急性肝損傷，其保肝機制可能與抗氧化平衡和抗炎促炎平衡有關(guān)，但具體機制還需進一步探究?？兹覆葑鳛橐环N觀賞性植物，藥用價值研究方面鮮有人問津，本文對其保肝作用進行研究，以期為將來孔雀草花應(yīng)用于臨床奠定基礎(chǔ)。