超表達(dá)枳β-淀粉酶基因( PtrBAM1)對(duì)煙草不同糖和有機(jī)酸的影響

肖 暢，彭 婷

(1.湖北廣播電視大學(xué) 導(dǎo)學(xué)中心，武漢 430000; 2.贛南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江西贛州 341000)

低溫脅迫常常引起植物新陳代謝的劇烈變化，酶活性和反應(yīng)速率普遍降低，代謝物得到重新配置。低溫馴化時(shí)，特定代謝產(chǎn)物如碳水化合物、氨基酸、有機(jī)酸等在植物體內(nèi)積累，其有利于增強(qiáng)植株的耐寒性[1]。

淀粉是植物體內(nèi)的主要碳水化合物，常見于根、根莖、莖、塊莖和種子等儲(chǔ)藏器官[2]。淀粉的合成主要是利用光合作用固定二氧化碳，并暫時(shí)存儲(chǔ)在葉綠體中，這種在24 h內(nèi)合成和降解的淀粉被稱為“暫時(shí)性淀粉”[3]。主要參與淀粉水解途徑的5種酶有α-淀粉酶(α-amylase)，β-淀粉酶(β-amylase， BAM)、極限糊精酶(limit dextrinase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)和α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase)[4]。淀粉水解產(chǎn)生的代謝物可用于谷物萌發(fā)、幼苗生長、胚乳發(fā)育以及對(duì)非生物脅迫的反應(yīng)等[5]。有研究[5]表明，淀粉水解代謝途徑的主要酶為BAM，主要產(chǎn)物為β-麥芽糖，其迅速被轉(zhuǎn)化為葡萄糖，用于蔗糖的合成，從而將葉綠體中的淀粉降解與細(xì)胞質(zhì)中的糖代謝聯(lián)系起來。

在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已經(jīng)鑒定有9個(gè)BAMs[6]，香蕉(Musanana)中有16個(gè)BAMs[7]，白梨(Pyrusbretschneideri)中17個(gè)BAMs[4]，枳(Poncirustrifoliata)中有8個(gè)BAMs[8]。其中， AtBAM3和PtrBAM1分別是擬南芥和枳葉片葉綠體中夜間降解淀粉的主要水解酶[9]。BAM不僅是植物中重要的淀粉水解酶，在植物非生物脅迫反應(yīng)中也具有重要作用。研究表明，BAMs能夠通過促進(jìn)活性氧的清除和增加可溶性糖類的含量以提高植株的抗脅迫能力[9-10]?？扇苄蕴且环矫孀鳛橹匾臐B透保護(hù)劑和相容性溶質(zhì)以減輕不良環(huán)境壓力對(duì)植物的影響[11]，另外一方面可作為信號(hào)分子與脫落酸(ABA)依賴的信號(hào)通路相互作用，激活應(yīng)激反應(yīng)級(jí)聯(lián)中的下游成分[12]。有機(jī)酸的積累和代謝受多種環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，但BAM對(duì)有機(jī)酸的影響目前鮮見報(bào)道。

盡管BAM在模式植物中已經(jīng)被鑒定，但是在多年生果樹中的抗非生物脅迫研究仍然較少。柑橘是一種亞熱帶果樹，性喜溫暖不耐寒霜，近年來隨著柑橘的廣泛種植和全球環(huán)境的不斷惡化，持續(xù)低溫以及春季“倒春寒”天氣成為制約柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大不利因素。研究柑橘在低溫條件下的響應(yīng)機(jī)制，提高其抗寒性具有重要意義。Peng等[8]從枳中克隆了與AtBAM3高度同源的PtrBAM1，該基因受到CBF(C-repeat-binding factor)的直接誘導(dǎo)，通過調(diào)節(jié)可溶性糖的整體水平，在耐寒性過程中發(fā)揮重要作用。本研究在已部分鑒定PtrBAM1抗寒功能的前提下，利用PtrBAM1超表達(dá)煙草，測定低溫條件下超表達(dá)PtrBAM1對(duì)煙草中β-淀粉酶活性、可溶性糖和有機(jī)酸含量的影響，進(jìn)一步解析PtrBAM1的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參試材料為野生型煙草nud、實(shí)驗(yàn)室前期獲得的3個(gè)PtrBAM1超表達(dá)煙草株系F6、F11、F25及轉(zhuǎn)化空載株系1301。以野生型nud和空載1301作為2個(gè)對(duì)照。

1.2 植株生長條件

盆栽種植的煙草置于智能人工氣候箱(HP400G3-C型)，光期/暗期為16 h/8 h，溫度 23 ℃。

1.3 材料處理

對(duì)2個(gè)月苗齡的nud、1301、F6、F11、F25煙草進(jìn)行2 ℃低溫處理，在0 h、6 h、1 d、3 d、5 d時(shí)取樣，葉片分裝于取樣袋后在液氮中速凍，置于 -80 ℃冰箱，備用。

1.4 β-淀粉酶活性與糖、酸含量的測定

采用Laby等[13]的方法測定β-淀粉酶含量。采用米蘭芳[14]氣相色譜法測定煙草中葡萄糖、蔗糖、果糖、蘋果酸、檸檬酸，奎寧酸含量，儀器為HP7890A型氣相色譜儀。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有測定數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。使用SAS 8.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，用t檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫下不同煙草株系β-淀粉酶活性檢測結(jié)果

不同煙草株系在低溫下其β-淀粉酶活性如圖1所示，可以看出，3個(gè)超表達(dá)株系的β-淀粉酶活性在正常情況下(0 h)、低溫處理6 h、1 d以及3 d均顯著高于nud、1301兩個(gè)對(duì)照組，并且隨著低溫時(shí)間的延長，其活性在1 d到達(dá)最高峰，隨后下降，到第5天時(shí)，超表達(dá)株系與對(duì)照相比酶活性無顯著差異。

數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”；相同字母間代表同一處理時(shí)間點(diǎn)不同株系間無差異，不同字母代表差異顯著(P<0.05)。下同 Data were “mean± SE”;different letters indicated significant difference among different lines at the same time point (P< 0.05).The same below

圖1 2 ℃處理下超表達(dá)煙草(F6、F11和F25)與
對(duì)照(nud和1301)β-淀粉酶活性比較
Fig.1 β-amylase activity of the overexpressing
lines (F6,F11,F25) and controls (nud,1301)
exposed to 2 ℃ treatment

2.2 低溫脅迫下不同煙草株系糖含量的差異性分析

不同煙草株系在低溫下其糖代謝的差異性如圖2所示。0 h時(shí)，超表達(dá)株系的果糖和蔗糖含量顯著高于對(duì)照，而葡萄糖含量顯著低于對(duì)照 (P<0.05)。從單個(gè)糖來看，除3 d和5 d外，超表達(dá)株系果糖含量均顯著高于兩個(gè)對(duì)照組，總趨勢為0 h到6 h下降后趨于平緩(圖2-A)。由圖2-B可知，在低溫處理下，對(duì)照組葡萄糖含量沒有顯著變化，超表達(dá)株系煙草的葡萄糖含量在 6 h～1 d時(shí)有一個(gè)驟升的過程，1 d與6 h相比增加 94.24%，說明在低溫脅迫前期，超表達(dá)煙草通過迅速提高葡萄糖含量來響應(yīng)低溫脅迫。由圖2-C可知，5個(gè)煙草株系蔗糖含量均在第1天時(shí)達(dá)到峰值，并且超表達(dá)株系顯著低于兩個(gè)對(duì)照，在其他時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照無顯著差異。綜上所述，在低溫脅迫下超表達(dá)PtrBAM1可能通過顯著提高煙草幼苗內(nèi)葡萄糖的含量以響應(yīng)低溫脅迫。

2.3 低溫脅迫下不同煙草株系有機(jī)酸含量的差異性分析

不同煙草株系在低溫下有機(jī)酸代謝的差異如圖3所示。低溫0 h、6 h和3 d，超表達(dá)煙草中蘋果酸含量均顯著高于2個(gè)對(duì)照(圖3-A)。對(duì)照和超表達(dá)株系的蘋果酸含量都是未經(jīng)過低溫處理時(shí)含量最高，之后逐漸下降，第5天已無法檢測到(圖3-A)。在低溫脅迫條件下，3個(gè)超表達(dá)株系檸檬酸含量始終顯著高于2個(gè)對(duì)照(圖3-B)。在低溫處理初期(0～6 h)，超表達(dá)煙草株系奎寧酸含量顯著高于對(duì)照組，低溫處理3 d和5 d均無法檢測到(圖3-C)。綜上所述，在低溫處理下，有機(jī)酸含量整體下降，但超表達(dá)PtrBAM1煙草可能因?yàn)樵? h的有機(jī)酸含量更高而抗寒性更強(qiáng)。

圖2 2 ℃處理下超表達(dá)煙草(F6、F11和F25)與對(duì)照(nud和1301)果糖、葡萄糖、蔗糖含量比較Fig.2 The content of fructose,glucose and sucrose of the overexpressing lines (F6,F11,F25) and controls (nud,1301) exposed to 2 ℃ treatment

圖3 2 ℃處理下超表達(dá)煙草(F6、F11和F25)與對(duì)照(nud和1301)蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸含量比較Fig.3 The content of malic acid,citric acid,quinic acid the overexpressing lines (F6,F11,F25) and controls (nud,1301) exposed to 2 ℃ treatment

3 討 論

在長期的進(jìn)化過程中，植物演化出了一系列復(fù)雜的機(jī)制來應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境，而糖代謝和碳分配在植物低溫馴化過程中起著重要作用[15-16]。糖代謝是一個(gè)復(fù)雜的酶促反應(yīng)，涉及如蔗糖、葡萄糖、果糖等多種可溶性糖，其可增加細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)能力，在脅迫中起著積極的作用，是植物響應(yīng)低溫處理最重要的初生代謝物[17-20]。

擬南芥在低溫脅迫下增加的第一批碳水化合物是由淀粉經(jīng)BAM水解產(chǎn)生的麥芽糖和麥芽三糖，接著是葡萄糖6-磷酸磷和果糖6-磷酸，然后是蔗糖、葡萄糖和果糖[21]，具體哪種糖在冷脅迫中起主要作用仍沒有定論。黑麥草植株暴露于低溫下8 h，其內(nèi)源性蔗糖的含量增加了10倍左右[22]。小于10 ℃的低溫貯藏條件下，馬鈴薯塊莖中可溶性糖如蔗糖、葡萄糖和果糖的含量顯著增加，溫度越低，可溶性糖含量越高[23]。擬南芥在4 ℃低溫脅迫下，蔗糖顯著增加，葡萄糖、果糖有少量增加，淀粉量輕微降低[24]?？偟膩碚f，可溶性糖在低溫脅迫下會(huì)明顯地積累，糖的類型取決于植物種類和脅迫的類型。本研究測定了低溫處理下PtrBAM1超表達(dá)系煙草葡萄糖、蔗糖和果糖的含量，其中葡萄糖含量在6 h～1 d時(shí)有一個(gè)驟升的過程。然而蔗糖在超表達(dá)煙草株系含量與對(duì)照組沒有顯著差異，表明超表達(dá)PtrBAM1沒有促進(jìn)蔗糖的積累，可能通過產(chǎn)生葡萄糖起作用，這與在麻風(fēng)樹幼苗中的研究結(jié)果相似[25]。Yu等[26]也認(rèn)為葡萄糖、果糖等單糖作為能源和滲透調(diào)節(jié)劑，而蔗糖等雙糖常常是植物運(yùn)輸和儲(chǔ)存碳水化合物等主要形式，說明不同植物種類可能會(huì)積累不同的代謝物以適應(yīng)脅迫。另一方面，在低溫處理后期，超表達(dá)煙草與對(duì)照的果糖(5 d)和葡萄糖(3 d)含量差異不顯著，可能PtrBAM1在抗低溫脅迫中對(duì)可溶性糖代謝的影響發(fā)生在早期階段。本研究中3種糖含量的測定表明超表達(dá)PtrBAM1低溫脅迫時(shí)促進(jìn)產(chǎn)生的可溶性糖主要成分是葡萄糖，超表達(dá)煙草通過迅速提高葡萄糖含量來響應(yīng)低溫脅迫。

有機(jī)酸(蘋果酸、檸檬酸等)主要來源于三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，在植物的呼吸作用和光合代謝中起著至關(guān)重要的作用，所以在高溫處理下由于代謝損傷和光呼吸通量變化導(dǎo)致大豆葉片中檸檬酸、蘋果酸等有機(jī)酸含量顯著降低[27]。番茄低溫寡照處理下，根系有機(jī)酸分泌量顯著降低[28]。本研究中在低溫處理下，有機(jī)酸含量也是整體下降，其中蘋果酸和奎寧酸經(jīng)歷了一個(gè)下降-升高-再下降的過程，這與番茄果實(shí)在4 ℃處理下，蘋果酸的含量先增加后下降相似[29]。PtrBAM1超表達(dá)煙草在0 h時(shí)蘋果酸、檸檬酸和奎寧酸含量都顯著高于對(duì)照，低溫開始后蘋果酸和奎寧酸都急劇下降。前期研究已證明PtrBAM1超表達(dá)煙草較對(duì)照更為抗寒[8]，可能是因?yàn)檎l件下超表達(dá)株系有機(jī)酸含量更高，因?yàn)橛袡C(jī)酸一方面能夠提高光合效率，另一方面可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的pH，可能在提高植物的抗逆性中起一定作用[30-32]。

4 結(jié) 論

綜上所述，正常條件下PtrBAM1超表達(dá)煙草的果糖、蔗糖、蘋果酸、檸檬酸、奎寧酸含量及β-淀粉酶活性顯著高于對(duì)照，低溫處理后超表達(dá)煙草β-淀粉酶活性和葡萄糖含量顯著增加，其他糖和有機(jī)酸含量都發(fā)生了改變，表明PtrBAM1在低溫處理下可能通過改變糖酸代謝途徑增強(qiáng)植株的抗寒性。具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。