NaHCO3脅迫對甘藍型油菜幼苗生長的影響及其耐鹽候選基因預(yù)測

陶順仙，張 燕，李 萍，燕佳琦，徐愛遐，黃 鎮(zhèn)

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

近年來，日益嚴重的土壤鹽堿化對作物生產(chǎn)產(chǎn)生嚴重影響，鹽堿脅迫顯著降低了作物的生產(chǎn)力[1-4]。根據(jù)糧農(nóng)組織(FAO)的數(shù)據(jù)，世界上至少有6%的土地受到鹽堿的影響，2.3億hm2的灌溉土地中有4 500萬hm2受鹽堿的脅迫[5]。改良鹽堿地和種植耐鹽堿作物均被用于緩解土地鹽堿化這一世界難題，而后者被認為是最為經(jīng)濟可行和最有效的方法。作物耐鹽性研究發(fā)現(xiàn)，甘藍型油菜中存在一些耐鹽性的種質(zhì)資源，是改良鹽堿地的重要作物。此外，中國油菜主產(chǎn)區(qū)油菜播種面積也呈現(xiàn)逐年下滑的趨勢[6-9]，急需在中國北方以及沿海地區(qū)增加油菜的播種面積[10]，但是這些地區(qū)存在大量的鹽堿地，因此必須解決油菜在鹽堿地正常生長的問題。

研究表明，當植株遭受鹽堿脅迫時，細胞膜的原生質(zhì)收縮而產(chǎn)生內(nèi)拉外張的應(yīng)力，脂質(zhì)層會被拉破，使細胞膜喪失選擇性，引起細胞內(nèi)的電解質(zhì)和非電解質(zhì)大量外滲，從而破壞細胞內(nèi)外離子平衡，幼苗細胞膜的受損程度與鹽堿脅迫強度密切相關(guān)[11]。滲透調(diào)節(jié)也是逆境生理適應(yīng)的主要機制之一，植物通過合成大量的小分子物質(zhì)，如脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白，幫助細胞維持一定的膨脹壓力，確保光合作用、呼吸作用、細胞代謝和其他生命活動的正常運行[12-13]。植物還通過體內(nèi)酶保護系統(tǒng)(SOD、POD、CAT)來維持植物體內(nèi)活性氧(ROS)的平衡，避免ROS的積累，有效減輕ROS對植物細胞的損傷[14]。

從已有的油菜耐鹽研究來看，多以NaCl脅迫作為處理方式，以Na+離子代謝、耐鹽性相關(guān)基因的分子生物學(xué)及鹽脅迫信息傳導(dǎo)等為主要研究方向。但是大部分的鹽堿土壤中不僅存在鹽離子，還存在OH-離子，堿對植物生長的影響往往要大于鹽離子的影響[15]。如果單純的研究中性鹽對植物的影響，其研究所取得成果很難有效應(yīng)用于生產(chǎn)中，因此很有必要研究植物對堿性鹽脅迫的響應(yīng)機制，目前甘藍型油菜該方面的研究并不多。因此，本試驗通過人工模擬堿性鹽脅迫，對甘藍型油菜苗期耐鹽性相關(guān)生理指標進行測定，研究其變化規(guī)律。同時利用qRT-PCR技術(shù)研究耐鹽相關(guān)基因的表達量變化，分析生理指標和基因表達量的相關(guān)性，初步確定甘藍型油菜抗堿性鹽可能的候選基因。本試驗將為甘藍型油菜耐堿性鹽育種及耐堿性鹽機理的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料、堿脅迫處理和取樣

選取籽粒飽滿、大小一致的耐鹽品系‘2205’和敏鹽品系‘1423’種子在25 ℃下催芽4 d，光周期為12 h，然后將其移入基質(zhì)。在受控條件下[16 h光照(25 ℃)/8 h黑暗(20 ℃)循環(huán)；光照度為10 000 lx，相對濕度60%～90%]，幼苗長到三葉期左右移入到含有75 mmol/L NaHCO3營養(yǎng)液中處理0、12、24 h(2個品系脅迫前后的表型見圖1)，分別取葉片于2 mL試管，每個品系在各個時間取樣，3次重復(fù)。將收集的幼嫩葉片立即放在液氮中冷凍，在-80 ℃下儲存用于生理指標測定以及基因表達量分析。

1.2 耐鹽相關(guān)基因的表達量分析

根據(jù)已經(jīng)公布的甘藍型油菜基因注釋，在甘藍型油菜數(shù)據(jù)庫(http://www. genoscope.cns.fr/brassicanapus/data/)中選擇6個與植物耐鹽相關(guān)的基因，見表1。

圖1 NaHCO3脅迫(0 h、24 h)對甘藍型油菜幼苗表型的影響Fig.1 Effects of NaHCO3 stress on phenotype of Brassica napus L. seedlings

表1 基因編號及GO注釋Table 1 Genes number and GO annotation

為了研究6個耐鹽基因在堿性鹽NaHCO3脅迫下的表達模式，采用RT-qPCR方法檢測NaHCO3脅迫后這些基因在耐鹽品系‘2205’和敏鹽品系‘1423’中不同時間點(0、12、24 h)的相對表達量。具體方法如下：用Primer 5.0設(shè)計特異性引物，引物由上海生工合成。根據(jù)天根生化科技有限公司RNA提取試劑盒提取不同時間點幼嫩葉片中的總RNA，檢測完整性和濃度，然后按照天根FastQuant RT試劑盒合成cDNA。以甘藍型油菜為內(nèi)參，cDNA鏈為模板，參照SYBR Green RT-PCR說明書進行實時熒光定量檢測。每個樣品進行3個技術(shù)重復(fù)，采用2-△△Ct法進行相對表達量的計算。

1.3 相關(guān)生理指標的測定

1.3.1 細胞膜透性 參考文獻[16]，將各個時間點的葉片用自來水洗凈并擦干，然后用打孔器打取9個圓葉片，然后放入加有10 mL去離子水的試管中，振蕩12 h，測其浸泡液電導(dǎo)率S1，再將試管封口置沸水浴中20 min，冷卻至室溫，搖勻后測其煮沸后浸泡液電導(dǎo)率S2，每個處理3個 重復(fù)。

1.3.2 可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸質(zhì)量分數(shù)及SOD和POD活性 取各個時間點油菜幼苗的葉片0.2 g，液氮研磨，1 mL(pH=7.8)磷酸提取液二次研磨，2 mL+2 mL磷酸提取液進行沖洗到10 mL離心管中。4 ℃、12 000 r/min離心30 min，上清液為待測液，每個處理3個重復(fù)。采用茚三酮比色法測定脯氨酸質(zhì)量分數(shù)[16]，蒽酮法測定可溶性糖質(zhì)量分數(shù)[17]，考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)[17]，氮藍四唑還原法測定SOD活性[17]，愈創(chuàng)木酚顯色法測定POD活性[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016軟件對NaHCO3處理后每個時間點的生理參數(shù) 和基因表達量進行多重比較(LSD)和相關(guān)性 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaHCO3脅迫后甘藍型油菜幼苗耐鹽基因表達量分析

如圖2所示，在NaHCO3脅迫后0、12、24 h，Bna23780D、Bna00850D、Bna12880D、Bna174 10D基因在耐鹽品系‘2205’的表達量高于敏鹽品系‘1423’，而Bna24820D基因在耐鹽品系‘2205’的表達量低于敏鹽品系‘1423’；Bna19240D基因在NaHCO3脅迫早期(0 h、12 h)，耐鹽品系表達量高于敏鹽品系，脅迫后期(24 h)敏鹽品系表達量高于耐鹽品系。其中，Bna17410D和Bna12880D基因的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在NaHCO3處理12 h后，基因表達量達到最大；Bna19240D、Bna23780D、Bna24820D、Bna00850D基因呈現(xiàn)一直上升的趨勢，在NaHCO3處理24 h后表達量達到最大。

2.2 堿性鹽NaHCO3脅迫下甘藍型油菜幼苗的生理反應(yīng)

2.2.1 細胞膜對油菜耐堿性鹽(NaHCO3)的反應(yīng)分析 如圖3所示，在NaHCO3處理后，兩品系的電導(dǎo)率均升高，而敏鹽品系‘1423’的上升趨勢更為明顯，12 h后與對照的差異達到顯著水平，24 h后達到極顯著水平。在耐鹽品系中，NaHCO3處理12 h、24 h后，耐鹽品系‘2205’的電導(dǎo)率與對照相比顯示出無顯著差異，這表明NaHCO3脅迫下敏鹽品系‘1423’幼苗的膜損傷更為嚴重。

2.2.2 抗氧化酶對油菜耐堿性鹽(NaHCO3)的反應(yīng)分析 圖4的結(jié)果表明NaHCO3脅迫下，兩品系幼苗葉片的SOD、POD活性隨時間的延長呈升高的趨勢，在24 h均達到最大值。堿性鹽NaHCO3處理12 h、24 h后，耐鹽品系‘2205’幼苗葉片的SOD活性分別顯著升高了60%和1倍，而敏鹽品系‘1423’的SOD活性分別增加了34%和43%，這表明NaHCO3脅迫下同一時間點耐鹽品系‘2205’的SOD活性高于敏鹽品系‘1423’。此外，NaHCO3處理12 h、24 h后，耐鹽品系‘2205’幼苗葉片的POD活性較0 h分別升高18%和35%，而敏鹽品系‘1423’的POD活性增加了12.6%和28%，這表明NaHCO3脅迫下同一時間點耐鹽品系POD活性也高于敏鹽品系。以上結(jié)果說明，耐鹽品系‘2205’的耐NaHCO3能力強于敏鹽品系‘1423’，而且SOD酶活性對堿性鹽NaHCO3脅迫更為敏感。

2.2.3 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對油菜耐堿性鹽(NaHCO3)的反應(yīng)分析 圖5結(jié)果表明，NaHCO3處理后，耐鹽與敏鹽品系葉片的脯氨酸質(zhì)量分數(shù)隨著時間的增加呈升高的趨勢，24 h時均達到最大值，耐鹽品系‘2205’與對照相比增加1.8倍，敏鹽品系‘1423’脯氨酸質(zhì)量分數(shù)增加了53%，其與對照差異達到極顯著或顯著水平。如圖6所示，2種油菜幼苗葉片的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)隨著NaHCO3脅迫時間的增加而略有升高，NaHCO3處理12 h后，耐鹽品系‘2205’中溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)升高了3.7%，同時敏鹽品系升高了4.5%，均與對照無顯著差異；脅迫24 h后，耐鹽品系與敏鹽品系中的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)分別升高 22.4%和11.2%，其與對照差異分別達到極顯著或顯著水平。如圖7所示，在NaHCO3處理后，兩品系的可溶性糖質(zhì)量分數(shù)均升高，而耐鹽品系‘2205’的上升趨勢更為明顯，24 h后與對照的差異達到極顯著水平，可溶性糖的質(zhì)量分數(shù)增加了1倍。在敏鹽品系中，NaHCO3處理24 h后，葉片中可溶性糖質(zhì)量分數(shù)與對照相比極顯著增加37.6%，差異也達到極顯著水平。圖5、圖6和圖7結(jié)果均表明NaHCO3脅迫激活了植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對逆境的生理反應(yīng)。

大寫字母表示在1%水平上差異顯著，小寫字母表示在5% 水平上差異顯著，下同 Uppercase letters indicate significant difference at 1% level,lowercase letters indicate significant difference at 5% level,the same below

圖2 NaHCO3脅迫下甘藍型油菜葉片耐鹽基因的表達分析
Fig.2 Expression analysis of salt-tolerant genes inBrassicanapusL. leaves under NaHCO3stress

圖3 不同時間點甘藍型油菜品系葉片的質(zhì)膜透性Fig.3 Leaf membrane permeability at different times in the Brassica napus L. cultivars

2.3 甘藍型油菜逆境基因相對表達量與耐堿性鹽相關(guān)生理指標的相關(guān)性分析

為了初步判斷所選基因是否為耐堿性鹽候選基因，筆者利用SPSS 20.0軟件分析耐鹽與敏鹽品系在NaHCO3脅迫后0、12、24 h幼苗葉片中耐鹽基因表達量與電導(dǎo)率、抗氧化物酶(SOD、POD)活性、脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖質(zhì)量分數(shù)的相關(guān)性。如表2所示，Bna12880D和Bna17410D基因的表達與兩品系的各生理指標的變化不存在相關(guān)性；Bna23780D基因的表達量與敏鹽品系‘1423’的超氧化物歧化酶(SOD)活性呈極顯著正相關(guān)，Bna24820D基因的表達量與敏鹽品系‘1423’的質(zhì)膜透性(EC)存在顯著相關(guān)性，與可溶性糖質(zhì)量分數(shù)呈極顯著正相關(guān)。Bna19240D基因和Bna00850D基因的表達與兩品系的逆境生理指標存在相關(guān)性，其中Bna19240D的表達量與耐鹽品系‘2205’的可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)存在顯著相關(guān)，與敏鹽品系‘1423’中質(zhì)膜透性(EC)和脯氨酸(Pro)質(zhì)量分數(shù)的變化呈顯著相關(guān)性；Bna00850D基因的表達量與兩品系中大部分生理指標的變化都存在相關(guān)性，與耐鹽品系‘2205’中的質(zhì)膜透性(EC)和可溶性糖(SS)質(zhì)量分數(shù)呈顯著正相關(guān)，與敏鹽品系‘1423’中的抗氧化酶(SOD、POD)活性、脯氨酸(Pro)質(zhì)量分數(shù)的變化存在顯著相關(guān)性。根據(jù)此結(jié)果，初步推斷Bna00850D基因可能是甘藍型油菜耐堿性鹽NaHCO3的一個候選基因。

圖4 NaHCO3脅迫下甘藍型油菜幼苗葉片POD和SOD活性Fig.4 POD and SOD enzyme activity in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

圖5 NaHCO3脅迫下甘藍型油菜幼苗葉片脯氨酸質(zhì)量分數(shù)Fig.5 Mass fraction of soluble proline in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

圖6 NaHCO3脅迫下甘藍型油菜幼苗葉片可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)Fig.6 Mass fraction of soluble protein in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

圖7 NaHCO3脅迫下甘藍型油菜幼苗葉片可溶性糖質(zhì)量分數(shù)Fig.7 Mass fraction of soluble sugar in leaves of Brassica napus L. seedlings under NaHCO3 stress

表2 耐鹽基因表達量與電導(dǎo)率、抗氧化物酶(SOD和POD)活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro、SS和SP)質(zhì)量分數(shù)間的相關(guān)關(guān)系Table 2 Correlation between salt-tolerant genes expression and stress physiology related indexes

注：“**”表示在1%水平上顯著相關(guān)；“*”表示在5%水平上顯著相關(guān)。

Note:“**” is significantly correlated at 1% level;“*” significant correlation at 5% level.

3 討論與結(jié)論

本試驗研究了堿性鹽NaHCO3脅迫后葉片生理指標的變化，這將為甘藍型油菜耐堿性鹽分子機理的研究提供生理參考依據(jù)。質(zhì)膜透性可以用來反映細胞膜損傷的程度[24]，植株遭受非生物脅迫時，細胞內(nèi)的電解質(zhì)和非電解質(zhì)大量外滲，使浸泡液的電導(dǎo)率有所增加。在本研究中堿性鹽NaHCO3脅迫后甘藍型油菜幼苗葉片的電導(dǎo)率升高，脅迫時間越久，細胞膜損傷越嚴重，敏鹽品系‘1423’幼苗的膜損傷更為嚴重，這與劉自剛等[25]研究NaCl脅迫對白菜型冬油菜種子萌發(fā)和幼苗生理的影響的結(jié)果大致相同。植物體內(nèi)通過積累脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等一些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵抗鹽堿脅迫[25-27]。本試驗中，隨著NaHCO3處理時間的延長，2種甘藍型油菜幼苗葉片中脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖質(zhì)量分數(shù)增加，而且耐鹽品系中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(Pro、SP)的質(zhì)量分數(shù)高于敏鹽品系，這可能是耐鹽品系保持較良好的胞內(nèi)生理狀態(tài)，有效地抵抗了鹽堿脅迫引起的水分脅迫。其次，在植物細胞所能忍受的活性氧范圍內(nèi)，植物也能夠通過活性氧清除系統(tǒng)抵御堿性鹽脅迫[28]，NaHCO3脅迫誘導(dǎo)甘藍型油菜幼苗葉片抗氧化酶(SOD、POD)活性的升高，SOD活性對堿性鹽NaHCO3脅迫更為敏感，這些表明SOD和POD是該甘藍型油菜品系堿脅迫下清除活性氧的重要酶類，在黃瓜和西瓜耐堿性鹽NaHCO3的研究中也有類似的結(jié)果[20，29]。

其他一些植物耐鹽研究探究了鹽脅迫下燕麥[30]和胡楊[31]葉片中生理指標以及耐鹽相關(guān)基因表達量的變化趨勢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理指標的變化與基因表達量的變化密切相關(guān)，從而推測這些基因影響了對應(yīng)生理指標的變化，因此可以通過這種方法初步推測哪些耐鹽基因是甘藍型油菜耐堿性鹽NaHCO3可能的候選基因。本試驗將甘藍型油菜數(shù)據(jù)庫中的6個耐鹽基因在堿性鹽脅迫下進行表達量分析，Bna23780D、Bna00850D、Bna12880D、Bna17410D基因在耐鹽品系‘2205’的表達量高于敏鹽品系‘1423’，而Bna24820D基因在耐鹽品系‘2205’的表達量低于敏鹽品系‘1423’。對6個基因相對表達量與生理指標的進行相關(guān)性分析，Bna00850D基因的表達量與兩品系中大部分生理指標的變化都存在相關(guān)性，因此初步推斷Bna00850D基因可能是甘藍型油菜耐堿性鹽NaHCO3的候選基因，同時有研究表明，植物體內(nèi)的谷胱甘肽在抵抗各種脅迫(冷害、干旱)的過程中起重要作用，而Bna00850D基因可能通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)的羥基谷胱甘肽水解酶活性(GO：0004416)、谷胱甘肽硫酯酶活性(GO：0047951)以及硫雙加氧酶活性(GO：0050313)對鹽脅迫做出反應(yīng)(GO：0009651)[32]。Bna00850D基因是否是甘藍型油菜耐堿性鹽NaHCO3的候選基因，最終需要對Bna00850D基因進行功能驗證，該工作目前正在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院油菜遺傳及分子育種實驗室進行。