天祝白牦牛 IGF-1基因克隆、生物信息學及差異表達分析

常永芳，包鵬甲，張永峰，付東海，吳曉云，褚 敏，閻 萍，

(1.西北民族大學 生命科學與工程學院，蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅省牦牛繁育工程重點實驗室，蘭州 730050)

牦牛是生活在高寒低氧地區(qū)、具有重要文化和生產(chǎn)意義的放牧動物，是高原上的生命之舟。其毛、肉、奶等副產(chǎn)品為藏牧民提供了有效的生活保障和經(jīng)濟來源[1]。天祝白牦牛產(chǎn)自甘肅省天祝藏族自治縣，是中國乃至世界的珍稀牦牛種質(zhì)資源，其被毛純白、厚密，頸部、肩部、背部多絨毛，體側(cè)部多長毛并與尾毛共同形成裙毛[1-2]，兼具利用價值和觀賞價值[2]。它的皮毛不僅具有抵御環(huán)境侵害(寒冷、強輻射和沙塵暴)、感覺、新陳代謝和調(diào)節(jié)體溫的作用，而且是制革和襯墊織物的高級原材料。毛囊是產(chǎn)生毛發(fā)的基本單位，由上皮細胞和真皮細胞之間相互作用形成。哺乳動物毛囊生長具有周期性，循環(huán)一般經(jīng)歷生長期、退行期和休止期。但受環(huán)境、季節(jié)以及個體差異影響，不同物種間毛囊生長周期存在一定差異，如內(nèi)蒙古絨山羊次級毛囊5-12月為生長期，1月份進入退行期，2-4月份為休止期；而兔子毛囊生長期經(jīng)歷兩輪，分別在每年1-4月和9-12月；藏綿羊毛囊生長期處于5-8月，11月份進入退行期，2月處于休止期[3-6]。毛囊的周期性活動伴隨著毛纖維的新生與脫落，且毛囊的這種循環(huán)生長受眾多生長促進和抑制因子之間嚴格控制的平衡調(diào)節(jié)[7-10]。因此，研究毛囊發(fā)育和周期性生長活動中的調(diào)控因子對改善牦牛毛品質(zhì)和產(chǎn)量具有重要意義。

胰島素樣生長因子(IGF)，是一種具有與胰島素相似結(jié)構(gòu)的同源單鏈多肽，通常與胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)相結(jié)合，以復合物的形式存在于機體組織或血液中。IGF包括IGF-1和IGF-2，均是由肝臟響應垂體分泌的生長激素(GH)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。IGF-1作為一種內(nèi)分泌激素，負責機體組織的生長和發(fā)育，例如肌肉、骨骼、腎臟、皮膚、肺和肝臟等，同時IGF-1作為一個強勁的有絲分裂原，可促進細胞生長、增殖、分化，同時可抑制細胞凋亡[11]。研究表明[12-13]，IGF-1可通過刺激毛囊的表皮和真皮成分，促進毛囊代謝，增加產(chǎn)毛量等。其受體IGF-1R大量存在于動物皮膚毛囊的毛球和外根鞘中，在間充質(zhì)細胞和表皮細胞中表達[11,14]。IGF-1通過與其受體(IGF-1R)相互作用來調(diào)節(jié)毛囊的生長周期，并刺激毛母質(zhì)和毛乳頭細胞的增殖和分化，同時抑制細胞的凋亡，對維持毛囊的生長周期至關重要[15-16]。研究表明，沉默與過表達IGF-1基因都會影響毛囊的發(fā)生及形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，外源性IGF-1會加快角質(zhì)細胞增殖，可有效促進體外培養(yǎng)毛囊的生長[17-18]。魏玉青[12]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1能夠通過調(diào)節(jié)IGF-1家族基因的表達來促進絨山羊毛囊發(fā)育并維持其毛囊形態(tài)結(jié)構(gòu)。此外，IGF-1基因還可促進白鵝次級毛囊的發(fā)育[19]；Trueb等[20]研究表明，IGF-1影響毛囊增殖、頭發(fā)生長周期以及毛囊分化，對人頭發(fā)的生長和防止脫發(fā)具有重要作用。目前，IGF-1對牦牛毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機制尚不明確，其在物種進化過程中相對保守，但也存在一定的種間差異。因此，本研究以天祝白牦牛皮膚組織為試驗材料，克隆天祝白牦牛IGF-1基因序列，分析其分子結(jié)構(gòu)及功能，并探究IGF-1基因在天祝白牦牛毛囊發(fā)育不同時期的表達特征，以期為該因子對毛囊發(fā)育和毛發(fā)纖維生長的調(diào)控及其功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

白牦牛均來自于甘肅省天?？h白牦牛養(yǎng)殖場，選取同一養(yǎng)殖場年齡相近(2～3歲)、飼養(yǎng)條件相同且相互之間無遺傳相關的3頭雌性空懷天祝白牦牛，分別在1、3、10月份采集這3頭牦牛的體側(cè)皮膚組織，用生理鹽水和PBS處理組織樣品表面異物，分裝標記并迅速投入液氮罐中，備用。

1.2 試驗試劑

DNA純化試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞、pMD 19-T克隆載體、DL 2 000DNA marker、2×TaqPCR Master Mix、膠回收試劑盒，均購自TaKaRa公司；Amp(氨芐青霉素)、Trizol均購自Solarbio公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總RNA提取及cDNA合成 通過TrizoI法提取皮膚組織總RNA，并通過NanoDrop儀器檢測RNA的質(zhì)量濃度和純度，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。以皮膚組織RNA為模板，使用TakaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成， -20 ℃保存，備用。

1.3.2 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中黃牛IGF-1基因mRNA序列 (登錄號: NM_001077828.1) ，利用NCBI在線工具Pick Primer設計引物，詳見表1。

1.3.3 目的片段的TA克隆與測序 以天祝白牦牛皮膚組織cDNA為模板進行PCR擴增，引物見表1，總反應體系20 μL：上下游引物各1 μL(10 μmo/L)，cDNA 1 μL， RNase-Free ddH2O 7 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min，4 ℃保存；用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物?；厥漳康钠?，將適量PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T克隆載體(16 ℃，30 min)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細胞中，挑取白色陽性單克隆菌落至LB (Amp+)液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)(37 ℃)，最后進行菌液PCR鑒定，選擇 PCR鑒定正確的陽性單克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行 測序。

1.3.4 生物信息學分析 利用ORF Finder在線程序?qū)Π钻笈GF-1基因序列進行開放閱讀框分析，并用BLAST進行序列同源性比對分析；使用ExPASy中的在線工具ProtParam和ProtScale分別分析IGF-1氨基酸序列的理化性質(zhì)和親疏水性；使用ExPASy中的SOPMA、SWISS-MODEL工具預測IGF-1蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)；使用SignalP 4.1和TMHMM在線工具預測牦牛IGF-1蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)；利用SMART和PSORT Ⅱ Prediction分析IGF-1蛋白的結(jié)構(gòu)域和亞細胞定位；利用Mega 7.0軟件構(gòu)建IGF-1基因的系統(tǒng)生物進化樹[21]。

表1 IGF-1基因引物序列Table 1 Primer sequences of IGF-1 gene

1.3.5 qRT-PCR技術檢測IGF-1基因的相對表達量 以皮膚組織的cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應體系(總體積為20 μL)：SYBRGreenⅡ 10 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60℃退火30 s，72 ℃延伸5 s，共39個循環(huán)。每個樣品3個重復，以GAPDH為內(nèi)參基因。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 利用2-△△Ct法計算毛囊發(fā)育3個時期的相對表達量，并使用SPSS 22.0軟件對IGF-1基因在牦牛毛囊發(fā)育不同時期的表達量進行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF-1基因PCR擴增檢測結(jié)果

如圖1 所示，擴增產(chǎn)物電泳條帶清晰明亮，特異性良好，且擴增片段的大小與預期一致。

1～2.IGF-1基因PCR產(chǎn)物 PCR products ofIGF-1gene；M.DL2000 DNA marker

圖1IGF-1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測
Fig.1 The electrophoresis of PCR
amplification products ofIGF-1gene

2.2 IGF-1基因克隆測序與序列分析

將克隆測序得到的序列與GenBank上黃牛IGF-1基因(NM_001077828.1)序列比對發(fā)現(xiàn)，第316位存在一個堿基差異(T→C)，為同義突變。序列分析表明，該序列包含一個長度為465 bp的完整開放閱讀框(圖2)，編碼154個氨基酸；76 bp處為起始密碼子(ATG)，540 bp處為終止密碼子(TAG)，堿基組成為A=22.58%、G= 28.60%、T=21.29%、C=27.53%，C+G (56.13%)高于A+T(43.87%)，說明IGF-1基因編碼區(qū)的DNA雙鏈比較穩(wěn)定。

圖2 IGF-1基因開放閱讀框分析Fig.2 The open reading frame analysis of IGF-1 gene

2.3 IGF-1蛋白基本理化性質(zhì)分析

基本理化性質(zhì)分析表明，天祝白牦牛IGF-1蛋白分子式為C744H1186N214O216S15，分子質(zhì)量為17 065.81 ku，理論等電點為9.36；含20種氨基酸(表2)，其中亮氨酸Leu (9.7%)、丙氨酸Ala (9.7%)的頻率最高，其水溶液在280 nm處的消光系數(shù)為8 075，半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為55.06，屬于不穩(wěn)定蛋白。親/疏水性預測結(jié)果顯示(圖3)，該基因編碼的蛋白質(zhì)疏水性最大值為 2.756(第37位)，最小值為-1.978(第127位)，總平均親水性為-0.249，為親水性蛋白。

2.4 IGF-1蛋白信號肽與跨膜結(jié)構(gòu)預測

天祝白牦牛IGF-1蛋白信號肽預測分析結(jié)果如圖4所示 ，Y-max為0.671、C-max為0.631、S-max為0.903，均大于閾值0.5，表明該蛋白存在信號肽區(qū)域，為分泌蛋白，氨基酸序列在1～49區(qū)域的S值較高，預測為信號肽區(qū)域；IGF-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖5所示，該蛋白存在一個跨膜結(jié)構(gòu)。

表2 IGF-1編碼蛋白中氨基酸的含量Table 2 Amino acid content of protein encoded by IGF-1 gene %

正值表示疏水，負值表示親水 Positive values indicate hydrophobic and negative values indicate hydrophilic

圖3 白牦牛IGF-1蛋白水親/疏水性預測
Fig.3 Prediction of hydrophilicity/hy
drophobicity of white yak IGF-1 protein

圖4 白牦牛IGF-1蛋白信號肽預測Fig.4 Prediction of signal peptide of white yak IGF-1 protein

圖5 白牦牛IGF-1蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測Fig.5 Prediction of transmembrane structure of white yak IGF-1 protein

2.5 IGF-1蛋白二、三級結(jié)構(gòu)分析

天祝白牦牛IGF-1蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，主要由α-螺旋(27.27%)、β-轉(zhuǎn)角(3.25%)、無規(guī)則卷曲(57.79 %)和11.69%的延伸鏈組成(圖6)；三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果基本一致(圖7)。三級結(jié)構(gòu)以3Iri.1.A為模板，序列相似度為87.34%，符合同源建模法中序列相似度大于35%的要求。

圖中豎線按照由長到短遞減依次表示α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲 The vertical lines in the graph according to descending order indicated alpha helix,extended strand,beta turn and random coil,respectively

圖6 白牦牛IGF-1蛋白二級結(jié)構(gòu)預測
Fig.6 Prediction of secondary structure of white yak IGF-1 protein

圖7 IGF-1蛋白三級結(jié)構(gòu)預測Fig.7 Prediction of tertiary structure of white yak IGF-1 protein

2.6 IGF-1蛋白結(jié)構(gòu)域及亞細胞定位分析

天祝白牦牛IGF-1蛋白包含一個結(jié)構(gòu)域，第52(Glu)至第110(Cys)位氨基酸為Insulin / insulin-like growth factor / relaxin family( IIGF)家族典型的保守結(jié)構(gòu)功能域(圖8)；IGF-1亞細胞定位預測結(jié)果表明：IGF-1蛋白在細胞核、線粒體、細胞外、細胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分泌系統(tǒng)囊泡中分別占65.2%、17.4%、4.3%、4.3%、4.3%和4.3%，在細胞核中分布最多。

2.7 IGF-1基因同源性分析

利用MEGA 7.0軟件對天祝白牦牛、黃牛、梅花鹿、馬鹿、山羊、綿羊、野豬、倉鼠、田鼠、鼠兔等物種的IGF-1氨基酸序列進行同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖9) 。結(jié)果顯示：天祝白牦牛與黃牛親緣關系最近，同源性為100%；其他依次為綿羊98%、梅花鹿98%、馬鹿97%、野豬97%、山羊96%、倉鼠92%、田鼠90%、鼠兔90%，表明IGF-1基因在哺乳動物進化過程中比較保守。

圖8 白牦牛IGF-1蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.8 Protein domains of white yak IGF-1

圖9 IGF-1基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of IGF-1 gene

2.8 qRT-PCR技術檢測 IGF-1基因相對表達量

qRT-PCR技術檢測IGF-1基因在牦牛毛囊發(fā)育不同時期的表達水平，結(jié)果表明(圖10)，在3 個時期均能檢測到IGF-1基因的表達，并且在生長期表達量最高，休止期表達量最低，生長期和退行期的表達量顯著高于休止期(P<0.05)，退行期表達量與生長期無顯著差異(P>0.05)。

上標不同字母表示差異顯著(P<0.05) Different letter on the bar indicates statistical difference(P<0.05)

圖10 毛囊發(fā)育周中期皮膚組織
IGF-1基因的mRNA表達水平
Fig.10 mRNA expression level ofIGF-1
in the skin of during hair cycle

3 討 論

本研究通過克隆白牦牛IGF-1基因CDS區(qū)，分析其序列特征，探究IGF-1基因在毛囊周期性發(fā)育中的功能。將獲得的天祝白牦牛IGF-1基因的編碼區(qū)序列與黃牛的序列比對，發(fā)現(xiàn)第316位發(fā)生1個堿基突變(TAT→TAC)，為同義突變。以往基因同義突變被認為不會引起功能性的變化，但近年來研究發(fā)現(xiàn)在密碼子高度保守的區(qū)域內(nèi)存在一種同義突變，影響基因表達、翻譯效率或蛋白質(zhì)折疊速率及蛋白質(zhì)構(gòu)象，甚至是蛋白質(zhì)功能[22]。對IGF-1氨基酸序列預測顯示，其編碼154個氨基酸，是不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；賈浩等[23]研究表明，蛋白質(zhì)的半衰期與其穩(wěn)定性呈正相關，而在本研究中IGF-1蛋白半衰期較長為30 h，卻不是穩(wěn)定性蛋白，這一研究結(jié)果與賈浩等[23]的研究報道不符，天祝白牦牛IGF-1基因出現(xiàn)這種不一致的特性，可能與其特殊的作用方式及與IGFS家族內(nèi)相關受體作用有關，需進一步研究和探討。各物種氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，天祝白牦牛與黃牛IGF-1氨基酸序列同源性為100%，相似度最高，不同物種之間IGF-1基因存在較高保守性，這意味著該基因在人、小鼠、絨山羊、牦牛等多種哺乳動物皮膚毛囊中的作用具有相似性；天祝白牦牛IGF-1蛋白結(jié)構(gòu)域預測結(jié)果表明，該蛋白在第52～110位氨基酸含有一個Insulin / insulin-like growth factor / relaxin family( IIGF)家族典型的保守結(jié)構(gòu)功能域，為該基因功能的深入研究提供理論參考。

毛發(fā)的生長主要受毛囊和其他表皮細胞間的相互作用影響，毛囊周期性循環(huán)過程中毛囊細胞的激活以及新舊毛干的交替受多個生長因子和信號通路的共同調(diào)控。IGF-1通過與其受體結(jié)合促進 IGF-1R 酪氨酸殘基磷酸化，也可通過MAPK、ERK1/2信號通路，激活IGF-1的生物學效應，從而觸發(fā)下游反應，最終刺激細胞分裂，調(diào)控動物的生長發(fā)育[24-26]。研究IGF-1基因在天祝白牦牛皮膚組織中的表達趨勢發(fā)現(xiàn)，該基因在毛囊發(fā)育不同時期均有表達，但毛囊發(fā)育生長期IGF-1表達量顯著高于休止期，這與魏玉青[12]和劉逍等[19]的研究結(jié)果基本一致。由于生長期毛囊生長處于最活躍的狀態(tài)，此時毛乳頭持續(xù)增大且毛囊隆突部的干細胞迅速增殖，毛母質(zhì)細胞的增殖分化能力不斷增強，使得毛囊和毛干不斷生長[27-28]，推測IGF-1可能在毛囊生長期刺激毛囊增殖分化中發(fā)揮重要作用。此外，IGF-1能夠通過激活RNA聚合酶等活性，來促進非組蛋白的磷酸化，同時增加mRNA水平[29]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在毛囊發(fā)育過程中IGF-1被認為具有調(diào)節(jié)細胞增殖和遷移的作用，需通過與特定的細胞表面受體結(jié)合來激活細胞，進而發(fā)揮其生物學作用[24,30]，同時IGF-1在許多細胞類型中被認為是一種抗凋亡的生存因子，可能在毛囊周期的生長期抑制細胞調(diào)亡，從而維持毛囊生長期[31]。由此推斷IGF-1基因可能通過刺激毛囊細胞的生長活動參與調(diào)控白牦牛毛囊發(fā)育及其周期性變化。由于毛囊的周期性活動是由眾多生長促進和抑制因子之間嚴格控制的平衡和相互作用來調(diào)節(jié)的，是一個復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，因此IGF-1自身以及與其他因子的相互作用對哺乳動物毛囊發(fā)育及其毛發(fā)生長的調(diào)控機理還需進一步探索。

4 結(jié) 論

通過RT-PCR技術成功克隆天祝白牦牛IGF-1基因CDS序列，并研究發(fā)現(xiàn)IGF-1基因在白牦牛毛囊發(fā)育不同時期皮膚組織中呈規(guī)律性表達。表明IGF-1基因參與調(diào)控白牦牛毛囊的生長及毛囊的周期性循環(huán)，為解析白牦牛毛囊發(fā)育及被毛生長提供理論依據(jù)，同時也為研究IGF-1基因在白牦牛毛囊生長發(fā)育中的作用機制提供理論基礎。